[发明专利]一种无胃温水性鱼肠细胞悬浮培养方法

权利要求书

1.一种无胃温水性鱼肠细胞悬浮培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1、选择体重400-600g的健康鲤鱼或草鱼，用2％乌拉坦溶液浸泡麻醉，待鱼体翻倒后，切去头部，破坏脊髓；按常规方法将鱼体表消毒，无菌取出整个内脏，去除肠道表面的系膜组织，用Hanks液洗净肠道内容物；

A2、先将肠道一端扎住，用Hanks液充满肠道，另一端用止血钳夹住，在室温下孵育10分钟；然后弃去溶液，以除去肠内可能残余的食糜和黏液；

A3、再用溶液-2充满肠道，两端用止血钳夹住，在20℃下，40转/分，振荡孵育15分钟；然后将肠腔内含有肠细胞的溶液收集起来；再用溶液-2充满肠腔，两端用止血钳夹住，在20℃下，40转/分，振荡孵育15分钟；

A4、将收集的肠细胞悬液混合在一起，在1500×g冷冻离心10min；

A5、收集的细胞沉淀用溶液-3重新悬浮，在25℃振荡孵化15min，肠细胞悬液经100-μm孔径血液尼龙网过滤，在1500×g冷冻离心10min；细胞沉淀重新悬浮在溶液-4中，供试验使用；

A6、细胞膜完整性用0.5％台盼蓝染料排斥法检测；细胞悬液和染料等体积混合，滴加在计数板上，盖上盖玻片，静止1分钟后计数死细胞数和细胞总数，计算细胞活力；

A7、细胞悬液在1500×g冷冻离心10min，分别测定上清液和细胞沉淀乳酸脱氢酶(LDH)的活性；

A8、台盼蓝染色法确定细胞活力在90％以上，将细胞浓度调整为12×10⁶cell/ml，用于培养实验；轻轻混匀细胞悬液，取试验所需的细胞悬液数量，26℃振荡培养，70转/分，培养总时间为240min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液-2为：Hanks液+0.2mMEDTA；所述溶液-3为：DMEM培养液+42U胶原蛋白酶I；所述溶液-4为：DMEM培养液+0.5％胎牛血清。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中分离液与组织的 适宜比例为1∶10。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤8)分离肠细胞的悬浮培养条件处理包括以下内容：使用细胞培养瓶密闭培养；所用培养液DMEM液中包含：1.1mg/ml谷氨酰胺，3.7g/L碳酸氢钠，200IU/ml青霉素，200IU/ml链霉素。