[发明专利]诱导间充质干细胞定向分化为心肌细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用骨髓间充质干细胞的生物学特性，分离扩增成人骨髓间充质干细胞，加入特定浓度的小分子有机化合物MS-818，体外定向诱导分化为心肌细胞的方法。

背景技术

冠心病心肌梗死及心力衰竭是严重影响人民生活质量和寿命的主要疾病之一。研究资料显示，成熟的心肌细胞缺乏再生能力，心肌梗死(MI)发生后，梗死区心肌只能通过纤维组织增生，由无收缩功能的疤痕组织代替，导致心功能下降。临床上缺乏针对梗死心肌再生、重建的根本性治疗方法，而细胞替代治疗应运而生成为一个理想的治疗策略。骨髓间充质干细胞(Mesenchymai stem cells，MSCs)，是在骨髓中的一种类似成纤维细胞的一类细胞，具有多方向分化潜能，可以向骨组织、软骨组织、皮肤、造血干细胞支持介质、骨骼肌细胞及心肌细胞转化。自体骨髓间充质干细胞还具有取材方便、无免疫原性、具有多向分化潜能、合乎伦理学要求并且无致瘤性，具有其它干细胞不可比拟的优势，因此，探讨hMSCs体外大量扩增及向心肌细胞诱导分化条件将对损伤心肌的修复治疗具有深远意义。在研究MSCs向心肌细胞分化诱导中，目前主要使用化学诱导剂5-氮胞苷(5-azacytidine，5-AZA)。5-AZA是胞苷的类似物，它可以与DNA共价结合形成复合物从而导致DNA甲基在细胞分裂周期中进行性丢失，发挥去甲基化作用，启动MyoD等某些相关等位基因的表达。国外有学者将成年小鼠骨髓基质细胞经5-氮胞苷诱导后，能产生自主收缩的肌管结构的细胞团，显微镜下结构类似胚胎心肌细胞。但细胞经过5-AZA处理后可导致细胞部分脱壁，降解、或胞浆内形成脂肪空泡，说明5-AZA作为一种诱导剂对细胞也有一定毒性。

MS-818是一种嘧啶化合物，化学式为：C₁₁H₁₅N₅O·C₄H₄O₄，分子量为339，其结构式如下：

R：CH₃

在2002年日本学者Sugiyama等曾发现MS-818可使手术切割后的成年大鼠肌肉的再生加速，促进肌肉恢复(Noriyuki Sugiyama et al，Nerve 25(2)218-229，2002)。但目前MS-818诱导人间充质干细胞(hMSCs)向心肌细胞定向分化的研究尚未见报道。在本发明中我们将hMSCs体外分离、扩增后，加入MS-818，探索骨髓间质干细胞在体外转化为心肌细胞的过程及方法，为MSCs体外扩增后自体回输治疗心肌梗塞提供实验依据。

发明内容

本发明涉及一种利用骨髓间充质干细胞的生物学特性，分离扩增成人骨髓间充质干细胞，加入小分子嘧啶化合物诱导剂MS-818，体外定向诱导分化为心肌样细胞的方法。

本发明的目的是提供一种将人骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)扩增后体外定向诱导分化为心肌细胞的方法。为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：利用MSCs的生物学特性，采用密度梯度离心法分离富集人MSCs，利用干细胞的自我更新和增殖特性对干细胞进行扩增获得大量干细胞。分离出的干细胞在特定培养代数(第3-7，10代细胞)，以特定小分子嘧啶化合物MS-818，特定浓度(100μM)进行诱导。分离出的干细胞的体外诱导定向分化方案的另一个特征是使用bFGF促进细胞增殖及心肌细胞表型表达。

本发明可为心肌细胞损伤后提供补充来源，为干细胞移植替代临床治疗心肌梗死及晚期心功能不全等奠定了基础，具有很好的临床应用前景。

附图说明

图1为MS-818诱导组和5-AZA诱导组培养间充质干细胞经a-actin单克隆抗体免疫染色照片(25x)。其中，A.MS-818诱导组；B.5-AZA诱导组。图1实验结果表明：MS-818和5-AZA诱导组均有a-actin抗原表达，证明诱导后有横纹肌细胞存在。

具体实施方式

实施例1、MS-818(2-呱啶-6-甲基-5-氧-5，6-二氢(7H)-吡咯[3，4-d]嘧啶马来酸)的制备