[发明专利]霍乱弧菌的链置换扩增恒温扩增(SDA)快速检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种霍乱弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒，其特征在于包括：

(1)模板预处理反应液：1×NEB buffer 2，1.0μM上游内引物S1、1.0μM下游内引物S2、3％(V/V)二甲基亚砜、和ddH₂O；

所述1×NEB buffer 2为：5mM NaCl、1mM Tris-HCl、1mM MgCl₂、0.1mM二硫苏糖醇、和ddH₂O，pH 7.9；

所述引物S1、S2分别如SEQ ID NO：1和2所示；

(2)链置换扩增反应液I：3％(V/V)二甲基亚砜，0.1mg/mL牛血清白蛋白，浓度分别为0.2mM的dATP、dGTP和dTTP，1.0mM dCTPαS，1×NEB buffer 2，和ddH₂O；

(3)Bst DNA聚合酶；

(4)限制性内切酶BsoBI。

2.使用权利要求1所述试剂盒检测霍乱弧菌的方法，其特征在于包括步骤：

(1)待检样品或细菌DNA的提取：

提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内；

(2)模板预处理程序：

取模板预处理反应液23μL，加入待检DNA 2μL，放入94℃水浴5min后迅速放入59℃的水浴中45s；然后94℃水浴25s和59℃水浴45s过程反复进行6个以上循环；产物用作SDA模板；

(3)SDA扩增：首先将上述预处理的25μL模板溶液加入24.2μL链置换扩增反应液I中，95℃水浴加热5min，温度迅速冷却到0℃，然后加入0.4μL Bst DNA聚合酶与0.4μL BsoBI，置于59℃水浴反应1h；

(4)核酸凝胶电泳检测：

反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳检测；电泳板上出现100bp的核酸扩增条带，说明待检样品为阳性，否则为阴性。