[发明专利]基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法

权利要求书

1.基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法，其特征在于：1) 制备适合于获取核酸序列拷贝数信息的磁性介质；2) 设计能与目标核酸序列特异性结合的引物与探针，探针5’端的修饰对应1)所述磁性介质上所修饰之功能化基团，之后以产物捕获方式获取目标核酸片段的拷贝数信息，产物捕获方式指先进行引物延伸反应，再利用磁性介质表面连接的特异性探针与延伸反应产物之间的碱基互补配对捕获延伸得到的核酸片段；3) 根据引物设计数据确定Tm值，根据Tm值确定退火温度，加入杂交缓冲溶液，经过变性与退火过程，使引物与变性成单链的DNA模板充分结合；4) 加入延伸反应缓冲溶液，进行一个循环后结束反应，再加入已制备的连接有特异性探针的磁性介质与延伸产物进行杂交反应，从而捕获目标核酸片段至磁性介质；5) 磁分离，对磁性介质进行清洗，即得到获取了待测模板中目标核酸片段拷贝数信息的磁性介质；6) 对反映至磁性介质上的模板中的目标基因与内参基因核酸片段进行化学发光检测，比较目标基因/内参基因核酸片段化学发光比值在待测模板与对照模板中的差异从而得到目标基因在待测模板中相对于对照模板中的拷贝数变化信息。

2.根据权利要求1所述基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法，其特征在于所述磁性介质为体现磁学性质的物体。

3.根据权利要求2所述基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法，其特征在于所述体现磁学性质的物体为具有磁学性质的物质构成的物体或以具有磁学性质的物质为部件的物体。

4.根据权利要求1所述基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法，其特征在于所述延伸反应体系为常规使用的PCR缓冲体系，所使用的酶为普通的Taq DNA聚合酶、Vent^- DNA聚合酶或DeepVent^- DNA聚合酶。

5.一种基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法，其特征在于制备步骤为：

a.磁性颗粒制备，采用溶剂热法制备直径在300 nm的四氧化三铁磁性颗粒：称取1.35 g的FeCl₃·6H₂O、3.6 g的醋酸钠以及1.0 g聚乙二醇溶解于40 mL乙二醇中，磁力搅拌溶解，形成黄褐色胶体；将胶体转移至四氟乙烯反应釜，密封，置于200℃烘箱中反应8小时；反应完成后以乙醇与去离子水清洗，烘干后得Fe₃O₄磁性颗粒；用100mL 0.1mol 盐酸浸泡Fe₃O₄磁性颗粒1小时，超声分散30分钟；再重新分散于体积浓度80%的乙醇中，以25℃、280 转/分搅拌，同时加入200 μL正硅酸乙酯，反应1小时；以乙醇、去离子水交叉洗涤；将颗粒重新分散于100 mL乙醇中，加入1.0 g十六烷基三甲基溴化铵，超声30分钟，在25℃、300转/分条件下搅拌，同时加入1 mL 正硅酸乙酯，反应3小时后，以乙醇、去离子水交叉洗涤数次，最后以乙醇分散，于4℃保存；制备得到核-壳结构的Fe₃O₄SiO₂复合颗粒；磁性纳米颗粒的氨基化，将上述制得的Fe₃O₄SiO₂复合纳米磁性颗粒磁分离，加入至乙醇/水混合溶液中并超声分散，然后将10 μL APTS滴加到以上混合溶液中，并在室温下振荡搅拌7小时，利用外加磁场将APTS修饰的磁性颗粒从反应介质中分离出来，用乙醇溶液对其清洗5次，磁分离，再用二甲基甲酰胺清洗5次，最后以5 mg/mL的浓度分散于DMF中，待用；氨基化磁性纳米颗粒的羧基化，取分散于DMF溶液中的氨基化SiO₂/Fe₃O₄磁性纳米颗粒，浓度为5 mg/mL，逐滴加入到等体积丁二酸酐浓度为0.001M的DMF溶液中，室温下反应24小时，用水洗涤数次后磁分离，加入双蒸水定容至10 mg/mL；即得到功能性的羧基化磁珠；将上述羧基化磁珠用等体积2-N-吗啉代乙磺酸水合物溶液反复清洗，磁分离，加入100 μM以MES溶液稀释的氨基化探针至清洗过的磁珠中，混合均匀后室温下旋转孵育30 分钟，立刻加入冷的以MES溶液溶解的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺至磁珠中混合均匀，再以MES溶液补足体积至50 μL，在4℃条件下旋转孵育2小时，每20分钟摇匀一次，磁分离后吸去上清，将磁珠于50 mM，pH 7.4 Tris溶液中孵育15分钟以中和没有反应的活化的羧基基团，再以50 mM，含0.1 %wt Tween-20的Tris清洗磁珠，最后以溶于PBS中的BSA溶液封闭磁珠；即得到了连接有特异性探针的功能化磁珠；

b.设计一对能与GAPDH、GSTT1与GSTM1基因特异性结合的引物与探针，探针5’端以氨基修饰，通过氨基-羧基相互反应将探针固定至磁性颗粒表面；

c.延伸：加入10×Buffer 2 μL、25 mM  Mg²⁺ 2μL、2.5 mM  dNTP 1.5 μL、上下游引物各2.5 μL，DNA模板2.5 μL、DNA聚合酶0.5 μL，加去离子水补足体积至20 μL，将反应混合物置于PCR仪中；PCR参数：94℃ 5分钟；95℃ 30秒，54℃ 30秒，72℃ 1分钟，1个循环；将得到的双链延伸产物进行变性，通过碱基互补配对原则将变性后的单链延伸产物与连有特异性探针的磁性颗粒杂交，然后将连有单链DNA的磁性颗粒磁分离，进行清洗；从而得到反映了目标基因拷贝数信息的磁性介质；

d.对反映至磁性介质上的模板中的目标基因与内参基因核酸片段进行化学发光检测，比较目标基因/内参基因核酸片段化学发光比值在待测模板与对照模板中的差异从而得到目标基因在待测模板中相对于对照模板中的拷贝数变化信息。