[发明专利]一种卵黄抗体的制备方法、用该方法制得的卵黄抗体及其应用

权利要求书

1.本发明涉及的一种卵黄抗体的制备方法，其特征在于：

1.1中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗的制备

将中蜂囊状幼虫病毒用BCA法检测浓度，用PH=7.4~7.8的磷酸盐缓冲液将病毒浓度稀释至0.2~0.3毫克/毫升，按稀释后的囊状幼虫病毒溶液体积的0.3~0.4%加入甲醛灭活24~48小时后，按稀释后的囊状幼虫病毒溶液体积的4~8%的加入吐温-80，做水相；司本-80与10号白油按体积比1: 9~1: 19混合，灭菌，做油相；水相与油相体积比为1:3~2:3，先将油相在8000~10000rpm搅拌，再缓慢加入水相，10000~12000rpm搅拌4~6分钟，进行无菌检验后，制得中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗，所制疫苗为油包水型；

1.2卵黄抗体的制备

用制备的中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗免疫产蛋鸡，首次免疫肌肉注射0.5~1毫升，之后第14~15天，第28~30天免疫加强1次，剂量加大至首次注射剂量的2~4倍，经三次免疫后，用间接ELESA法测定抗体效价，当效价达到2⁸以上时，收集鸡蛋，储于 4~8℃，以后每隔30~35天免疫一次所述产蛋鸡，以保证有效抗体效价在2⁸以上；对收集到的鸡蛋用水合法提取卵黄抗体IgY。

2.根据权利要求1所述的卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的中蜂囊状幼虫病毒通过以下步骤得到：

2.1用RT-PCR检测阳性的患病幼虫与pH=7.4~7.8的磷酸盐缓冲液先混匀，每1g患病幼虫加磷酸盐缓冲液1~2ml，磨碎后的混合液加入氯仿，氯仿与所述混合液的体积比1:0.8~1:1.5，在37~40℃下匀浆8~10 min，然后800~1200 rpm离心8~10min，分别收集上清液和沉淀物；

2.2取上清液，在上清液中加入与其体积比为1:0.8~1:1.5的氯仿，在37~40℃水浴中振摇8~10 min，然后800~1200 rpm离心8~10 min，分别收集上清液和沉淀物；

2.3上清液继续用步骤2处理2~4次，分别收集上清液和沉淀物；

2.4将所得沉淀物收集在一起，用pH=7.4~7.8的磷酸盐缓冲液溶解，每1g沉淀物加1~2ml磷酸盐缓冲液，然后800~1200 rpm离心8~10 min，取上清液，与之前经过多次处理的上清液混合，然后5000~8000 rpm离心25~30min，取上清液，10000~15000rpm离心25~30 min，再取上清液，35000~45000 rpm离心50~60 min，弃去上清液，将最后离心得到的沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，得到中蜂囊状幼虫病毒。

3.根据权利要求1所述的卵黄抗体的制备方法，采用水合法提取卵黄抗体IgY时其特征在于：

用蒸馏水将卵黄液稀释，其中卵黄抗体与蒸馏水的体积比为1:9~1:10，搅拌15~30min，用0.1mol／L的HCL调节PH= 5.0~5.2 后，放置 4~8℃冰箱 6~12 小时；然后以4~8℃，8000~10000 r／min离心25~30min, 用医用纱布过滤，取上清液，浓缩。

4.如权利要求1或2或3所述方法制备得到的卵黄抗体。

5.按照权利要求4所述的卵黄抗体在防治中蜂囊状幼虫病的药物中应用。

6.根据权利要求5所述的卵黄抗体在防治中蜂囊状幼虫病的药物中应用，其特征在于：

将效价调整到2⁵的卵黄抗体溶液，通过直接溶解糖或喷雾的方式给予蜜蜂，饲喂量为15~25毫升/天/框，隔天饲喂1次，连续饲喂三周。