[发明专利]一种改进的大肠杆菌植酸酶HTP6M及其基因和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及提高大肠杆菌植酸酶耐温性的方法及一种突变改良的耐温植酸酶HTP6M及其编码基因和应用。 

背景技术

植酸酶是一种能水解植酸的酶类。植酸(Phytate，Phytic acid，IP6)又称肌醇六磷酸脂，结构复杂。植酸分子含有6个磷酸基团，带有丰富的磷，植酸是饲料中磷的重要贮存形式。植酸酶(EC3.1.3.8)即肌醇六磷酸水解酶，催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸。 

磷是动物机体必需矿物元素，单胃动物体内缺乏分解植酸的植酸酶。造成饲料中磷的利用率仅有1/3或更低，为了补充有效磷的不足，必须在饲料中添加无机磷酸盐，常用的为磷酸氢钙和骨粉。这样不仅大大增加了饲料的成本，而且大量的植酸磷不能被利用而直接排出体外，造成磷源的浪费和严重的环境问题。单胃动物饲料中通过添加植酸酶，可以提高饲料中植酸磷的利用率，减少磷的排出对环境的污染。 

通过基因工程手段，特别是DNA重组技术的应用，使各种微生物来源的植酸酶大规模廉价生产和实际应用成为可能。现工业化生产的植酸酶主要有来源于黑曲霉的真菌植酸酶和来源于大肠杆菌的细菌植酸酶两种。其中来源于大肠杆菌的植酸酶APPA具有高比活性及良好的消化道稳定性等特点。目前主要通过在粉末饲料直接添加或颗粒饲料后喷涂的方法应用在饲料行业。 

在颗粒饲料生产过程中有一个短暂的80-90℃的高温阶段。细菌植酸酶APPA热稳定性较差，其水溶液在70℃下保温5分钟剩余酶活性低于30％，直接添加到动物饲料中进行制粒后存留酶活一般低于20％，使APPA植酸酶在颗粒饲料的应用受到限制。采用饲料制粒后植酸酶液体喷涂到饲料上的方法不仅增加设备投入，而且对酶制剂的稳定性、饲料中分布均一性都无法很好的保证。因此，利用生物工程手段提高植酸酶热稳定性是目前饲料用植酸酶的研究热点之一。 

发明内容

本发明总的目的是通过基因突变的方法对植酸酶氨基酸序列进行改造，使改造后的植酸酶在温度的耐受性方面更加优良。构建基因重组克隆，使改造后的植酸酶高效表达，最终达到工业化生产的要求。 

本发明是以大肠杆菌植酸酶APPA为模型植酸酶进行突变筛选。来源于大肠杆菌的植酸酶APPA已经被克隆并测序(The complete Nucleotide sequence of the Escherichia coli gene appA reveals significant homology between pH2.5 Acid phosphatase and glucose-1-phosphatase.Journal of Bacteriology，Sept.1990，p.5497-5500)。该基因全长1299bp，(GeneBank号码：M58708).编码432个氨基酸(见图2)。[魏春宝1]N端的22个氨基酸为信号肽，去除信号肽的大肠杆菌植酸酶可以在毕赤酵母细胞分泌表达获得具有植酸酶活性的成熟蛋白。Ostanin，K.通过基因突变，高效表达APPA植酸酶，提高表达效率400倍，达到400mU/mg蛋白。(Ostanin，K.et al.Overexpression，Site Directed Mutagenesis，and Mechanism of Escherichia Coli Acid Phosphatase.J.Biol.Chem.267：22830-36，1992).姚斌等在中国发明专利ZL 02137869.X公布了一种大肠杆菌植酸酶APPB，其于来源于大肠杆菌的植酸酶APPA基因有较高同源性，氨基酸序列同源性达到97.9％，有9个氨基酸的差异，分别对应APPA的第51，53，101，151，201，251，252，301，302位。如图2.该植酸酶具有良好的胰蛋白酶稳定性。其活性的最适温度范围和APPA植酸酶相似，为35-60℃。 

本发明提供了一种突变改造的植酸酶，它是以来源于大肠杆菌的植酸酶APPA为模型植酸酶，通过对第47、92、136、159、164、237位氨基酸残基进行取代得到的。本发明获得的植酸酶耐温性较现有技术中的植酸酶有明显提高，经70℃热处理后存留酶活在90％以上。在80℃饲料制粒时，存留植酸酶酶活超过80％， 

在本发明的一个优选实施方案中，本发明所述植酸酶序列如SEQID NO：2所示。