[发明专利]一种敲除牛MSTN基因的打靶载体及其应用

权利要求书

1.一种敲除牛肌肉生长抑制素MSTN基因的启动子捕获型打靶载体。

2.如权利要求1所述的打靶载体，其包含MSTN基因上下游同源臂3’同源臂和5’同源臂，所述5’同源臂的最后一个碱基为MSTN第一外显子起始密码子上游最后一个碱基，在同源臂之间还具有标记基因。

3.如权利要求2所述的打靶载体，其特征在于，所述5’同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO：1的8834～10133；3’同源臂核苷酸序列如SEQID NO：1的15091～21957。

4.如权利要求2所述的打靶载体，其特征在于，所述标记基因包括报告基因EGFP和带有启动子PGK的新霉素抗性选择基因Neo^r。

5.如权利要求1～4之一所述的打靶载体，其为PIII-MSTN，质粒图谱如图1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3。

6.一种扩增权利要求1～5之一所述的打靶载体中MSTN基因同源臂的引物，其分别包括5’同源臂和3’同源臂的上游序列和下游序列的两组PCR引物对。

7.如权利要求6所述的引物，其特征在于，所述引物为：

5’同源臂上游引物：TTTAAGCTTTCATTTGATTAGACCTTGTGGCTCC，

5’同源臂下游引物：TTTAAGCTTGGTTTTAAAA TCAATACAATCTTTT；

3’同源臂上游引物：GATCCGCGGCATGGTAGTAGATCGCTGTGGGTGT，

3’同源臂下游引物：AATCCGCGGAGTAGAATGGTCTTGAATGGTTAGGA。

8.一种构建权利要求1～5之一所述打靶载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取牛组织基因组DNA；

2)以权利要求6或7所述的引物用PCR方法从步骤1)的基因组DNA中克隆MSTN基因的长短同源臂，分别为3’同源臂和5’同源臂；

3)将同源臂克隆到表达载体经限制性内切酶和测序分析进行鉴定；

4)将鉴定正确的同源臂连接到基础载体PIII中，该基础载体核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，构建得到敲除牛MSTN基因的打靶载体。

9.如权利要求8所述的方法，其中步骤2)所述的PCR方法扩增5’同源臂，其反应条件为：95℃变性50s，60℃复性50s，72℃延伸2min，共35个循环；所述的PCR方法扩增3’同源臂，其反应条件为：95℃变性50s，59℃复性50s，72℃延伸7min，共35个循环。

10.一种敲除牛MSTN基因的方法，其特征在于，利用电转染的方法将权利要求1～5之一所述的打靶载体导入胎儿成纤维细胞中，通过同源臂的置换，达到敲除MSTN基因的目的。

11.如权利要求1～5之一所述的打靶载体在培育肉用牛品种中的应用。