[发明专利]霍乱弧菌毒素基因多重实时荧光定量PCR检测试剂盒及方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种霍乱弧菌毒素基因多重实时荧光定量PCR检测试剂盒及方法。

(二)背景技术

霍乱是由霍乱弧菌引起的急性肠道传染病，是《中华人民共和国传染病防治法》规定的甲类传染病之一，具有发病急、传播快、波及范围广等特点，曾在世界上引起多次大规模流行。主要表现为呕吐、失水、腹泻等症状。目前认为只有O1和O139血清群霍乱弧菌引起霍乱疫情，主要的致病因素取决于菌体本身携带的生物学特征，霍乱弧菌的毒力因子包括霍乱毒素(Cholera toxin，CT)、小带联结毒素(Zonula occludens toxin，ZOT)、辅助霍乱肠毒素(Accessory cholera enterotoxin，ACE)等。在疫情防制过程中，分离的霍乱弧菌是否携带毒素是判定疫情极为重要的参考指标，不携带毒力因子的霍乱弧菌通常致病力不强，仅引起腹泻等轻微临床症状，不会导致大规模流行。因此，对霍乱弧菌菌体携带的毒力因子进行检测、对产毒株与否的鉴定是及时、有效地判断疫情暴发机率和评价疫情严重性的前提和基础，为进一步采取防制措施提供可靠的依据。

目前，霍乱弧菌常规检测以传统培养方法为主，不仅操作繁琐，耗时长，无法判定菌体内是否含有毒力因子。针对霍乱弧菌毒素分子鉴定主要依靠动物实验模型和细胞方法、免疫学实验方法，实验周期长，动物个体差异较大，可比性不强，操作步骤繁多，而且每次实验只能对一种目标毒素进行检测，无法同时鉴定多种毒素因子，无法达到疫情控制的需要。分子生物学技术能够在很大程度上提高检测效率，目前已经广泛应用于病原菌的检测和毒素基因鉴定领域。但是由于菌体携带毒力因子的状况比较复杂，依靠多重荧光定量PCR技术能够通过一次实验操作得到较为完整的菌体携带毒素因子信息。

(三)发明内容

本发明涉及一种针对霍乱弧菌三种毒素基因的多重荧光定量PCR检测试剂盒和方法，根据霍乱毒素A亚单位基因(ctxA)、辅助霍乱肠毒素基因(ace)、小带联结毒素基因(zot)设计特异性引物和探针，对霍乱弧菌菌体携带毒力基因情况进行准确、有效地甄别。

本发明采用的技术方案是：

一种霍乱弧菌毒素基因多重实时荧光定量PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和探针以及PCR反应试剂，其特征在于，所述特异性引物和探针由霍乱毒素A亚单位基因(ctxA)、辅助霍乱肠毒素基因(ace)和小带联结毒素基因(zot)的特异性引物和探针组成：

ctxA上游引物F1：5′-AAC GTT AAT GAT GTA TTA GGG GCA T-3′

ctxA下游引物R1：5′-GTT ACT GTAATA TCT ATC TCT GTA G-3′

ctxA探针P1：5′(HEX)-ATA CTC CCA AAT ATA TGG ATGGT-(BHQ1)-3′

ace上游引物F2：5′-GGA GAT GTC CCA GAAAGT GAT TG-3′

ace下游引物R2：5′-CGG GTC ATC AAA GCC TGAAG-3′

ace探针P2：5′-(FAM)-TGC TGC CTC CTC AAT ACA GCGGCT-(BHQ1)-3′

zot上游引物F3：5′-CAC CAC GGC TGG GAT ATC TG-3′

zot下游引物R3：5′-CTATCT CCG CCG CCT CTC T-3′

zot探针P3：5′-(Cal610)-CAC GCC TAA CAT TGC CAA AGTGCA-(BHQ2)-3′

其中FAM、HEX和Cal610为不同波长的荧光报告基团(FAM的激发/接受波长为495nm/512nm，HEX的激发/接受波长为535nm/556nm，Cal610的激发/接受波长为590nm/610nm)，BHQ1和BHQ2为荧光淬灭基团。

本发明的关键在于扩增引物的设计，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择。PCR反应试剂包括PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶等，其中PCR缓冲液可采用市购商品，也可自行配制，例如将Tris-HCl、KCl、MgCl₂等按比例混合进行配制，进行检测时，将PCR反应试剂和扩增引物和探针混合，再加入待测样品或对照品，即可进行PCR扩增反应。

为达到定量检测的效果，所述试剂盒还可包括霍乱毒素A亚单位基因(ctxA)、辅助霍乱肠毒素基因(ace)和小带联结毒素基因(zot)的标准品，所述标准品序列如下：