[发明专利]用于检测小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型的引物、探针及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种用于检测小鼠呼肠孤病毒III型的引物、探针及其方法。

背景技术

自然感染实验动物的病毒很多，根据对人类的危害性，可将其分为三类；一类为人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物；二类目前尚无迹象表明感染人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性；三类病毒在自然条件下仅感染动物本身，目前尚无迹象表明能够感染人，因此对人类威胁不大。

现今，小鼠作为单克隆抗体、蛋白类药物等生物制品的一个主要来源，具有潜在的病毒污染。在《中华人民共和国药典(2010年版)》三部中，规定了鼠源性生物制品需质检的8种鼠源病毒，其中小鼠呼肠孤病毒III型属于一类，人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物，对人体来说有很大的危险性。因此，鼠源性病毒检测标准的制定对客观评价生物制品质量，确保人民健康必将起到积极的作用。

呼肠孤病毒(Reoviridae)全称为呼吸道(respiratory)、肠道(enteric)和孤儿(orphan)病毒。呼肠孤病毒的基因组是分节段的双股RNA。1994年ICTV第6次病毒分类报告中，统一定位为属，将呼肠孤病毒科下设正呼肠孤病毒属、环状病毒属、轮状病毒属、科州蜱传热病毒属、水生呼肠孤病毒属、斐济病毒属、植物呼肠孤病毒属及水稻矮缩条叶枯病毒属。

呼肠孤病毒分为I、II和III型，其中呼肠孤病毒III型(Reovirus 3，Reo3)属于呼肠孤病毒科的正呼肠孤病毒属，Reo3具有特征的二十面体对称的双层衣壳结构，病毒粒子的核心由十条双链RNA基因组以及其密切链接的内衣壳组成，此外还有一层外衣壳，无囊膜，是呼肠孤病毒中致病性最强的。该病毒能感染所有哺乳动物，在啮齿类动物群体中多呈隐性感染。Reo3可引起小鼠“油毛综合征”，表现为黄疸、腹泻、矮小、毛皮油亮以及神经症状如运动失调等。还可引起乳鼠多种系统性疾病，包括坏死性肝炎、心肌炎及胰腺炎以及脑膜炎等病变，死亡率可达50％。

药典规定的鼠源病毒检测方法有：细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验。这些方法从生物效应角度来检测鼠源病毒的潜在污染，检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求，不宜作为一种常规的指导生产的质控手段。

而目前发展十分成熟的实时荧光定量PCR技术(Real-time Fluorence Quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)检测灵敏度高，简单方便，且对实验室要求也很低。Real Time PCR于1996年由美国Applied biosystems公司推出，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量分析的方法。该方法自产生以来，不断发展完善，特别是随着Taqman荧光探针的广泛应用，到目前为止该技术已经非常成熟。Taqman荧光探针的PCR检测是指进行PCR扩增时，在反应体系中加入一对引物的同时还加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基因和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基因所发射的荧光信号被淬灭基因吸收，扩增时随着Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’-3’外切核酸酶活性将探针酶切降解，报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可以监测到荧光信号，模板每复制一次，就有一个探针被切断伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一关系，所以信号累积与PCR产物完全同步。整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及样品中的扩增曲线可对样品进行定量分析。

实时荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该已被广泛用于免疫分析、细菌、病毒检测等多个领域。迄今为止，实时荧光定量PCR技术检测小鼠呼肠孤病毒III型方面还未见有报道，无疑有着很广阔的发展空间。

发明内容

为了解决现有小鼠呼肠孤病毒III型检测方法的不足，本发明提供了一种实时荧光定量PCR检测小鼠呼肠孤病毒III型的引物、探针及其方法，该方法简单方便、灵敏度高且检测时间短。

本发明的一个目的是提供一对用于检测小鼠呼肠孤病毒III型的引物。