[发明专利]采用水培技术快速繁殖转基因青蒿的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种水培种植技术领域的方法，具体是一种采用水培技术快速繁殖转基因青蒿的方法。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能。可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。

目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01％-1％)，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具有可行性。另外，青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1％，在芽中最高也只有干重的0.16％，而大多数研究者在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程生产青蒿素的可行性也不高。

随着青蒿素生物合成途径研究的逐渐深入以及植物次生代谢工程的不断发展，利用转基因技术提高青蒿中青蒿素的含量是一种颇具前景的方法。2009年，本实验室Zhang等同学在《Biotechnol.Appl.Biochem.》(《生物技术和应用生物化学》)发表了题为“Development of transgenic Artemisia annua(Chinese wormwood)plants with an enhanced content of artemisinin，an effective anti-malarial drug，by hairpin-RNA mediated gene silencing”(“构建RNAi载体并利用转基因技术使抗疟疾药物青蒿素在转基因青蒿中的含量得到提高。”)的论文，报道了通过转基因技术可明显提高青蒿中有效成分青蒿素含量这一实验结果。目前，本实验室已得到多个不同品系且青蒿素含量较高的转基因青蒿。然而，转基因青蒿一般为杂合体，不具备遗传稳定性，后代中基因发生分离，不利于农业生产。从转基因青蒿培育纯系品种需要很长的时间，而且耗费大量的人力物力，这使得转基因青蒿的大面积推广受到了一定的限制。

现有资料中目前已有通过微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿植株的方法。然而，微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿植株需要经转基因青蒿外植体的脱毒，转基因青蒿微不定芽的诱导，转基因青蒿微不定芽的伸长，转基因青蒿不定芽的生根以及转基因青蒿再生植株的移栽等多个步骤，过程较为复杂，其中多步需要无菌操作，稍有不慎就易引起青蒿外植体污染，致使扩繁失败。且在转基因青蒿外植体的脱毒过程中需要使用升汞等剧毒试剂，容易对操作人员身体造成损害，对周围环境造成污染。

通过水培技术快速繁殖转基因青蒿，为保持转基因青蒿的遗传稳定性，对转基因青蒿的大面积推广、保障充足优质的青蒿种苗、提高青蒿素的产量具有重要意义。且可以克服现有转基因青蒿水培扩繁技术中种种弊端，省时，低耗，是一种极具应用前景的生物技术。目前尚未发现与本发明主题所提及的采用水培技术快速繁殖转基因青蒿的相关报道。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种采用水培技术快速繁殖转基因青蒿的方法，通过水培培养液的配方和水培快速扩繁的方法，建立了用水培技术快速繁殖转基因青蒿的方法，能够在短时间内繁殖出大量的转基因青蒿苗，并且保持转基因青蒿的遗传稳定性，对于转基因青蒿的大面积推广、保障充足优质的青蒿种苗、提高青蒿素的产量具有重要意义。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明通过将转基因青蒿外植体置于水培诱导培养液中避光培养得到不定根后移栽到移栽基质中，通过驯化获得转基因青蒿植株。

所述的转基因青蒿外植体是指：含青蒿内源基因的植物双元表达载体转入根癌农杆菌(如EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar 1)，在根癌农杆菌介导下，再经过外植体的预培养，农杆菌与外植体的共培养，抗性再生植株的筛选和转基因青蒿植株的PCR检测后所得到转基因阳性植株。

所述的水培诱导培养液的组分为：1g/L全水溶性肥料(花无缺，20-20-20+TE，通用肥)以及10mg/L吲哚乙酸(IAA)，余量为水。