[发明专利]检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球及其制备方法和应用。 

背景技术

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是由垂体和下丘脑分泌的多肽，广泛存在于神经组织、成纤维细胞和巨噬细胞中。作为一种广谱有丝分裂原，其具有极强的生物活性：①对来源于中胚层和神经外胚层的各种细胞均有促增殖作用、趋化作用和促细胞迁移运动作用；②能促进剖面毛细血管新生，改善了微循环和组织的营养状况，同时促进成纤维细胞和成肌细胞的增殖，使肉芽迅速生长；③增强源于中胚层的免疫细胞的活性，提高剖面的抗感染能力。研究表明，bFGF在机体内参与多种组织的创伤修复过程，是机体内重要的创伤愈合因子之一。创伤后bFGF的含量高低能直接反映创面修复中的血管生成水平，为检测和监测创伤修复和组织愈合情况等提供依据。 

在临床上，碱性成纤维细胞生长因子可用于治疗颅脑、脊髓、周围神经损伤，中毒，感染，脑出血、脑梗塞、脑萎缩、脑发育不良，角膜溃疡，神经性耳聋，面瘫，粘膜、皮肤损伤，烧伤，慢性溃疡，软组织损伤，内脏损害，骨折，一些内分泌疾病，断肢再植和各种手术后的伤口愈合等。bFGF可以促进损伤愈合，大大缩短病程，改善预后，但迄今对于损伤创面中原发bFGF含量的检测方法不多，且检测灵敏度、检测限和抗干扰能力等亟待提高。目前，有关bFGF免疫检测技术的研究报告和相关专利技术国内外报道很少，迫切需要开发高效、准确、快速的新型免疫检测技术和产品。 

发明内容

本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种用于检测灵敏度较高，且操作简单、重复性强，最低检测限为mbFGF蛋白60pg/ml的检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球及其制备方法和应用。 

本发明目的的实现方式为，一检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球，是用单分散羧基化聚苯乙烯微球为基质材料，用羧基-氨基化学偶联方法偶联抗mbFGF多克隆抗体获得的免疫胶乳微球，是由抗mbFGF蛋白多克隆抗体包被的微球，微球颗粒大小50nm。 

检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球的制备方法，具体步骤如下： 

(1)根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰并构建全长小鼠bFGF基因表达序列； 

(2)将小鼠bFGF基因片段通过限制酶切割插入谷胱甘肽-S-转移酶GST基因融合表达载体中，构建细菌融合表达载体； 

所述谷胱甘肽-S-转移酶基因融合表达载体是pGEX-4T-3，构建完成后的融合表达载体是pGEX-4T-3-mbFGF； 

(3)对细菌融合表达载体进行细菌表达后，利用亲合层析柱纯化获得GST-mbFGF融合蛋白；所述亲合层析柱为Glutathione Sepharose 4B； 

(4)利用凝血酶在柱切割GST-mbFGF融合蛋白，洗脱物经亲合层析柱去除凝血酶后，获得小鼠bFGF；亲合层析柱为Benzamidine Sepharose 4B Fast Flow： 

(5)将弗氏佐剂溶合抗原后免疫兔，经分离纯化得到兔抗mbFGF多克隆抗体；所述抗原为mbFGF蛋白； 

(6)将步骤(5)所得到的兔抗mbFGF多克隆抗体，通过羧基-氨基化学偶联法偶联活化微球，得到检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球； 

所述微球是单分散羧基化聚苯乙烯微球，大小50nm，表面载基团为羧基， 

所述微球的活化是首先用活化剂碳化二亚胺活化微球，然后加入保护剂Sulfo-NHS使微球形成稳定的活泼酯中间体，以备连接抗体分子。 

检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球的的应用，通过酶标仪，采用酶联免疫吸附测定法，检测mbFGF样品的bFGF。 

本发明采用单分散羧基化聚苯乙烯微球为基质材料，用羧基-氨基化学偶联方法偶联抗mbFGF多克隆抗体获得免疫胶乳微球，取材简单、操作方便；制备方法细致严谨，重复性高；所制备的免疫胶乳微球颗粒小，粒径均匀，经酶联免疫吸附测定(ELISA)最低检测限为重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子60pg/ml，相关 系数R²＝0.96。 

附图说明

图1是羧基化聚苯乙烯微球扫描电镜照片， 

图2是mbFGF基因原序列， 

图3是菌落PCR验证mbFGF基因插入片段电泳， 

图4是质粒XbaⅠ酶切电泳，