[发明专利]一种可克隆微藻启动子的T载体的制备方法及应用

权利要求书

1.一种可克隆微藻启动子的前T载体的制备方法，其步骤是：

A、可克隆微藻启动子的前T载体的构建：

(1)以pBle1：5′-GTAGATATCATGGCCAGGTG-3′，pBle2：5′-GCGGGTACCTTAATTAAGCTTC-3′)为引物，通过PCR从质粒pSP124中扩增出大小为970bp的ble-RBCS2终止子：94℃3min；94℃1min，58℃1min，72℃1min，25个循环，72℃10min，克隆进pMD 18-T载体中，获得T-p124质粒，并经测序确认，通过EcoRⅤ和Kpn Ⅰ限制性内切酶双酶切质粒T-p124获得ble-3′RBCS2终止子，将它插入pSP124载体的EcoRⅤ和Kpn Ⅰ酶识别位点，获得pB124载体；

(2)pB载体的构建：通过Eam1105Ⅰ限制性内切酶单酶切pB124载体，获得线性载体，再经T4DNA Polymerase使载体末端平滑化，突变原有的Eam1105Ⅰ酶识别位点，通过T4连接酶连接载体，获得pB载体；

(3)pRB载体的构建：通过Eam1105Ⅰ单酶切pSP124载体(含RBCS2启动子-ble-RBCS2终止子)，获得线性载体，再经T4DNA Polymerase使载体末端平滑化，突变原有的Eam1105Ⅰ酶识别位点，通过T4连接酶连接载体，获得pRB载体；

(4)间隔序列的获得：以pB-bkt9：5′-TTGGATCCGACTTTACGTCCAGTTCCGTGACATTGA-3′，pB-bkt10：5′-CAAGATATCGACGCTTCGTCTCGTCTAGCTGTGCTATG-3′为引物，通过PCR从质粒091127-a3中扩增出大小为450bp的产物，获得引入两个Eam1105Ⅰ酶识别位点、一个EcoRⅤ和BamH Ⅰ酶识别位点的启动子，作为前T载体的间隔序列并命名为5′bkt1-0.45；

(5)pB-0.45T载体的构建：通过EcoRⅤ和BamH Ⅰ限制性内切酶双酶切5′bkt1-0.45，将其插入pB载体的EcoRⅤ和BamH Ⅰ酶识别位点，获得pB-0.45T载体；

(6)pRB-0.45T载体的构建：通过EcoRⅤ和BamH Ⅰ限制性内切酶双酶切5′bkt1-0.45，将其插入pRB载体的EcoRⅤ和BamH Ⅰ酶识别位点，最后获得pRB-0.45T载体；

B、启动子序列的T克隆：

(1)T载体的制备：

pB-0.45T载体和pRB-0.45T载体经Eam1105I限制性内切酶双酶切，37℃1小时，酶切产物经1％质量体积比琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收大片段即为T载体，经一般的商业回收试剂盒纯化后直接应用于PCR片段的T克隆；

(2)启动子的PCR扩增：

PCR扩增后能在产物末端加腺嘌呤脱氧核苷酸(A)的PCR酶，常见的有Taq DNA扩增酶和长链DNA扩增酶，采用Pfu高保真酶扩增，在PCR产物上通过Taq扩增酶加腺嘌呤脱氧核苷酸才能用T载体；

(3)PCR片段的连接、转化：

T载体和PCR产物按1∶1或1∶3摩尔比混匀，加入T4连接酶连接，转化到感受态大肠杆菌XL1细胞中，经氨苄抗生素筛选获得克隆了启动子PCR片段的重组子，经T3或T7引物测序确定插入片段的序列信息。

2.权利要求1所述的一种可克隆微藻启动子的T载体在检测微藻启动子功能中的应用。