[发明专利]一种大葱种子的消毒方法

说明书

技术领域

本发明属于组织培养领域，具体涉及一种大葱组织培养中的种子消毒方法。

背景技术

大葱(Allium fistulosum L.)为百合科葱属二年生草本植物，富含钙、磷、维生素，不仅味道鲜美，而且具有医疗保健功效。据FAO统计，2009年我国栽培大葱面积达26560公顷，居世界第一位。

近年来，随着分子生物技术的迅速发展和基因工程的日趋普及，利用转基因植株生产药物、疫苗和生物制剂愈加展示出广阔的应用前景和潜在的经济效益。在转基因植株的研究中，无菌苗的筛选和培育是试验成功的关键，而无菌苗一般由种子获得，因此，种子有效消毒显得尤为重要。

迄今，各种灭菌方法报道颇多(杨岚等，2008；John H et al.，1985；R.L.M.Pierik，1987；Trevor A，1981；吴良欢等，1997，1999)，但是有关大葱种子消毒的方法鲜有报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种大葱组织培养中种子消毒的有效方法。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明一方面涉及一种大葱种子消毒方法，其特征在于：使用含有吐温-20的水清洗种子，然后消毒液消毒35分钟以上，但不超过1小时，所述的消毒液含有1-3％的次氯酸钠、次氯酸钾和/或次氯酸，浓度优选为2％。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于水中吐温-20浓度低于1％，优选低于0.5％，进一步优选低于0.1％。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于采用含有吐温-20的水清洗种子的时间介于20-40分钟之间。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于使用消毒液消毒之前采用消毒酒精漂洗清洗之后的种子。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于所述的漂洗时间为20-40s之间，优选为30s。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于使用消毒液消毒之后再次使用含有吐温-20的无菌水冲洗种子，最后使用无菌水冲洗至少一次。

本发明另一方面涉及采用上述消毒方法消毒之后的种子的培养方法，其特征在于将消毒后的种子接种到培养基上，在光照强10-40umol.m^-2.s^-1，光照周期为10-20h.d^-1，室温下培养。

本发明所述方法与现有的大葱组织培养中的种子消毒方法相比，具有发芽率高、污染率小的优点，并保证了较高的成苗率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步的说明，但本发明并不局限于此。本实施例均以山东省农业科学院蔬菜研究所提供的章丘大葱品种种子为试验材料。

应用实施例一

本实施例采用六种常用消毒方法对大葱种子进行消毒处理，并进行了添加吐温-20对大葱种子消毒效果的影响研究，通过调查大葱种子始发期、发芽率、发芽势、污染率等项目。

种子消毒处理方法：先将200粒大葱种子用自来水冲洗30min，然后置于超净工作台上用75％酒精漂洗0.5～1min，转入消毒液中进行消毒处理，最后用无菌水冲洗3-5遍，消毒处理后接种于MS培养基。

种子消毒处理设计：①2％的次氯酸钠中消毒20min；②2％的次氯酸钠中消毒40min；③2％的次氯酸钠中消毒60min。④0.1％的升汞中消毒5min；⑤0.1％的升汞中消毒10min；⑥0.1％的升汞中消毒15min。

添加吐温-20消毒处理大葱种子的试验

处理方法：先将100粒大葱种子用自来水冲洗30min，然后置于超净工作台上用75％酒精漂洗0.5～1min，转入2％次氯酸钠消毒40min，消毒后接种于MS培养基。

处理设计：①大葱种子消毒前，用自来水冲洗时在三角瓶中加入1-2滴吐温-20；②大葱种子消毒后，用加入吐温-20的无菌水(无菌水中按10000∶1的比例添加吐温-20)，冲洗3-5遍，最后用无菌水冲洗1遍；③处理1与处理2同时进行；④对照(CK)：正常消毒，不加吐温-20。

大葱无菌苗培养

将消毒处理后的种子，接种于MS培养基(经高压灭菌)培养，培养基中添加蔗糖3％，琼脂0.9％，pH5.8-6.0。培养温度25±1℃，光照强度3000Lx，光照时间每天16h。

培养10天时调查统计发芽势；培养30天时调查统计发芽率、污染率；第一粒种子发芽的时间为种子发芽始期。数据处理采用SPSS软件。

结果与分析如下：