[发明专利]大葱多倍体的诱导方法

说明书

技术领域

本发明涉及大葱四倍体的诱导方法，属于植株组织培养领域。

背景技术

大葱(Allium fistulosum L.)为百合科葱属二年生草本植物，富含钙、磷、维生素，不仅味道鲜美，而且具有医疗保健功效。据FAO统计，2009年我国栽培大葱面积达26560公顷，居世界第一位。近年来，大葱病害频发，严重影响其品质，因此利用细胞工程技术改良大葱显得尤为重要。自1937年Blakeslee和Avery发现秋水仙素具有诱导细胞染色体加倍效果以来，多倍体育种作为一种改良作物的有效方法得到广泛应用。

多倍体植株通常具有根茎粗壮、叶片肥厚、色绿、叶柄变宽、花器、果实、种子变大的形态特点；其生理活跃、新陈代谢旺盛、适应性强等特点，为植株自身的生长发育提供了更多的物质基础。目前，关于大葱不同组织器官的离体再生方面已有报道，但对于大葱多倍体诱导方面的报道较少。谢芝馨(2004)用秋水仙素处理大葱愈伤组织的过程中发现，多数愈伤由于秋水仙素的毒害作用慢慢褐化死亡，最终得到的变异材料外形畸形，很难生根；宗红(2007)在用秋水仙素诱导大葱愈伤组织时发现同样的问题，由于秋水仙素的毒害作用，愈伤组织褐化现象极其严重、不定芽分化受阻。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种诱导四倍体大葱的方法。

本发明一方面涉及一种大葱多倍体诱导方法，以大葱种子为材料，秋水仙素为诱导剂，其特征在于秋水仙素的浓度为介于0.4％-1.0％之间，处理时间在24-48h之间。

在本发明的一个优选实施方式中，大葱种子使用秋水仙素浓度0.8％处理48h。

在本发明的另一个优选实施方式中，采用上述方法处理后的大葱种子置于超净工作台上用消毒酒精漂洗0.5～1min，转入有效浓度1-3％(v/v)次氯酸钠消毒，用无菌水冲洗，将灭过菌的种子接种到培养基上，在光照强10-40umol.m^-2.s^-1，光照周期为10-20h.d^-1，室温下培养。

本发明还涉及上述诱导方法在提高大葱种子的变异株率中的应用。

为减轻秋水仙素的毒害作用，以大葱种子为材料，研究了秋水仙素处理浓度和时间对大葱体细胞染色体加倍的效果，并利用细胞染色体计数及流式细胞仪等方法进行倍性鉴定。结果表明，秋水仙素浓度0.8％处理48h的诱变效果最佳，染色体压片表明，四倍体染色体数为2n＝4X＝32，二倍体植株为2n＝2X＝16，并且用流式细胞仪对倍性进行进一步的分析验证。采用本发明的方法，可以显著的提高大葱种子的变异株率，可广泛应用于作物改良。

在本发明中，无如其它说明，所述的浓度均指重量百分比浓度。

具体实施方式

1.以章丘大葱种子为材料，秋水仙素为诱导剂，研究大葱染色体加倍的最佳处理时间和处理浓度的组合。

2.秋水仙素处理浓度分别为：0、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％，处理时间分别为24h和48h，共12个处理组合，每个处理100粒种子。

3.将大葱种子在秋水仙素中浸泡处理后，置于超净工作台上用75％(v/v)酒精漂洗0.5～1min，转入有效浓度2％(v/v)次氯酸钠消毒40min，最后用无菌水冲洗3-5遍。将灭过菌的种子接种到MS培养基上，在光照强30umol.m^-2.s^-1，光照周期为16h.d^-1，温度为(25±1)℃的条件下培养。

4.培养30天后，统计发芽数、发芽率、变异株数、变异株率、四倍体植株率(表1)。

以植株粗壮、叶色浓绿、生长缓慢为形态变异标准，统计变异株数及变异株率；以染色体计数及流式细胞仪的鉴定结果来统计四倍体植株率。

表1 秋水仙素不同浓度和处理时间的诱导效果

注：不同处理间差异显著性检验采用邓肯氏新复极差法。小写字母表示0.05水平，大写字母表示0.01水平。