[发明专利]人SPINK6的基因优化及其在毕赤酵母中外分泌表达

说明书

技术领域

本发明涉及利用重组DNA技术生产蛋白质领域。更具体的，本发明涉及基于酵母菌密码子偏爱设计优化的重组人SPINK6(rhSPINK6)的DNA序列，以及酵母菌外分泌表达生产高生物活性rhSPINK6的方法。

技术背景

生物体中，蛋白酶在生物学过程扮演非常重要的角色。除了降解食物外，蛋白酶的功能还包括纤溶、凝血、炎症、受精、发育等。丝氨酸蛋白酶是一类蛋白水解酶，因其活性中心含有一个丝氨酸位点而得名；丝氨酸蛋白酶分布广泛，在人类中，大约有150多个编码丝氨酸蛋白酶的基因，其中许多是属于类胰蛋白酶家族。类胰蛋白酶家族含有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶、血管舒缓素、顶体蛋白等。生物体中蛋白酶的功效是巨大的，但是其功能失控也会带来致命的影响。许多蛋白酶的功能受其抑制剂的紧密调控以不至于蛋白酶功能的失控；蛋白酶抑制剂是多肽或者蛋白，它作为蛋白酶的假性底物与反应部位紧密结合来抑制和调控蛋白酶的功能，能与体内参与各种调控作用的蛋白酶形成一定的动态平衡，调节生物体内的生命过程。到目前为止，有16000个蛋白酶抑制剂的序列被发现，并被分成67个家族，分别是丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或者金属蛋白酶抑制剂。

Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂属于蛋白酶抑制剂家族I1，存在于鸟蛋、昆虫、虾、哺乳动物组织和体液，与血凝、纤维蛋白溶解、胚胎发生、个体发育、食物消化、炎症和免疫应答等有着密切的关联。目前已经发现100多种Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂；人类基因组中，经典的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂主要有spink1、spink2、spink4、spink5、spink6、spink7、spink8、spink9、spink13等。经典的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构非常保守，特征是至少含有一个长度为40～60个氨基酸的Kazal结构域，含6个半胱氨酸形成的3对二硫键，活性位点在P₁位(第二个半胱氨酸后的第二个氨基酸残基)，许多抑制剂常含有一段信号肽，位于N末端，其长度大约为20个氨基酸。不同的P1残基能抑制同一种丝氨酸蛋白酶，而同一P1残基能抑制多种丝氨酸蛋白酶，丝氨酸蛋白酶活性部位“口袋”大小和P1残基侧链结构、极性、离子电荷等因素均影响酶-抑制剂的相互作用，当P1残基为Lys、Arg时，对胰蛋白酶和类胰蛋白酶有显著的抑制作用，而P1残基为Pro、Tyr、Phe、Leu、Met时，能抑制胰凝乳蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶，P1残基为Ala、Ser时，能抑制弹性蛋白酶。因此P1残基的突变能显著地改变抑制剂的专一性和结合能力。

对SPINK6的研究结果显示，SPINK6蛋白在皮肤角质层细胞中高表达，并可以通过特异性抑制激肽释放酶(Kallikrein，KLK)家族成员的活性抑制皮屑脱落与皮肤炎症的发生。KLK是一组高度保守的丝氨酸蛋白酶家族的一个亚群，广泛存在于各种组织和体液中，参与多种生理和病理过程。目前已发现15个KLK家族成员KLK1-15，其分子的异常表达被证明与多种疾病发生过程相关，如高血压，肾功能障碍，皮肤病变，炎症，中枢系统疾病以及肿瘤发生。其中，KLK表达与肿瘤发生发展的关系近来越来越被人们重视。其中KLK3(PSA)作为前列腺癌的诊断指标得到了FDA批准并得到了广泛的临床应用。目前，KLK的作用在众多激素依赖性肿瘤方面得到了证实，KLK2，KLK3(PSA)，KLK5，KLK6，KLK10和KLK11已相继被确定为卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌的标志物。大量研究表明，KLK可通过激活生长因子、促进血管生成、激活蛋白酶降解细胞外基质成分等参与肿瘤的侵袭转移过程。KLK蛋白能直接或间接地水解胞外基质蛋白，促进肿瘤细胞的游离，浸润和转移。研究显示KLK能分解大分子的胞外基质蛋白如胶原蛋白，纤连蛋白，层连蛋白，玻璃体结合蛋白等，促进肿瘤转移。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂LEKTI-1，2，在皮肤，免疫系统中被证明可以有效抑制KLK活性。

我们前期研究结果发现，SPINK6蛋白在肝癌细胞系中的高表达可以有效抑制肝癌细胞系的生长，迁移侵袭，并可以完全抑制体外软琼脂培养体系和裸鼠体内肿瘤形成。这一结果表明SPINK6分子可能在肿瘤抑制中发挥了关键性的作用。我们进一步研究发现，重组SPINK6蛋白加入肿瘤细胞培养体系可以有效抑制多种肿瘤细胞的侵袭能力。