[发明专利]一种海洋链霉菌卤化酶基因及其产物，以及其修饰产物的生物合成基因簇

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是海洋链霉菌卤化酶基因及其产物，另外还涉及卤化酶修饰产物的生物合成基因簇。 

背景技术

海洋链霉菌(Streptomyces xinghaiensis)是大连理工大学分离鉴定的一个海洋链霉菌新种（一株具有广谱抗菌活性的海洋链霉菌S187，中国发明专利200710158478.7），该菌种具有良好的抗耐药金黄色葡萄球菌MRSA菌株活性，同时对绿脓假单胞菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌以及白色念珠菌等也具有较好的活性，而其抗绿脓假单胞菌活性在所分离的所有菌株中比较突出。海洋链霉菌的16S rDNA序列与两个亲缘关系较近的标准菌种S. flavofuscus NRRL B-8036^T和S. albiaxialis DSM 41799^T同源性分别为98.1% 和97.5%，但基因组DNA-DNA杂交分析显示该菌种与两个标准菌种的相关性只有31.4%和46.9%。对海洋链霉菌进行深入研究，发现了一个卤化酶基因及其修饰产物的完整基因簇。 

卤化酶是修饰很多抗生素的重要修饰酶，对很多抗生素的活性具有重要的作用。由于FADH₂依赖型的卤化酶是许多抗生素生物合成基因簇中的后修饰酶，因此编码这类卤化酶的基因序列与多种抗生素的生物合成基因簇偶联。在生物合成的过程中，催化合成反应的中间进行卤代反应，从而对最终产物的生物活性产生影响。利用卤化酶作为新型生物催化剂，可产生新的药物分子用于临床治疗。 

卤化酶可修饰多种抗生素，包括四环素类，安莎类，β内酰氨类、糖肽类等。其中complestatin (chloropeptin II) 是含有卤化修饰结构的一种特殊的糖肽类化合物，与万古霉素、替考拉宁结构不同之处是其不含有糖基，它是由线性非核糖体多肽(non-ribosomal peptide, NRPS)进一步通过NRPS合成酶进行酚氧化偶联形成的刚性交联结构。早在1980年人们就发现complestatin具有较强的抑制人补体旁路途径的活性。作为人体重要的免疫防御系统之一，补体系统过度激活与类风湿性关节炎等多种疾病相关，而重症非典型性肺炎（SARS）也和补体系统的过度激活有关，因此开发高效低毒的抗补体药物对于相关疾病的治疗具有重要意义。研究者还发现complestatin具有较强的抑制艾滋病毒HIV-1整合酶的活性。此外，complestatin还可促进纤溶酶原自溶，也可作为阻止缺氧缺血等急性脑损伤造成的兴奋毒性细胞死亡的神经保护分子。由于complestatin的多种独特的生物活性，也吸引着人们进行化学合成研究，但直到2010年才报道了其化学全合成，但化学合成步骤多，难度较大。此外，complestatin溶解性不好，可能也是限制其药物开发的因素，因此其类似物的开发具有重要研究意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一种海洋链霉菌卤化酶基因，另外还提供其产物；本发明还提供利用卤化酶基因修饰产物的生物合成基因簇，其基因序列与complestatin的生物合成基因序列具有较高的同源性，但又具有其自身独特的基因组成。 

本发明公开一种海洋链霉菌卤化酶基因核苷酸序列，其特征为： 

（a）、含有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的核酸；和

（b）、与（a）所述核酸具有至少75％序列相同性、同时保留了卤化酶功能的核酸。

本发明一种包括编码基因序列的海洋链霉菌卤化酶蛋白质： 

（a）、含有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的蛋白质；和

（b）、在（a）的蛋白质的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有卤化酶功能的由（a）衍生的蛋白质。

本发明还公开所获得的海洋链霉菌卤代酶修饰产物基因簇序列，以已及分离获得该序列的方法，包括以下步骤： 

1）用Fosmid 载体构建插入片段约为35-40kb 的海洋链霉菌基因组文库；

2）将所获得的文库转染细菌，平板涂布，经鉴定文库合格后挑取平板上的单克隆于培养基中培养；

3）提取培养的单克隆的DNA，PCR 扩增，并对PCR 扩增产物进行检测，获得含有卤代酶基因的阳性克隆；和对该阳性克隆进行测序，获得该卤代酶基因全长以及修饰产物基因簇序列；