[发明专利]表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株及在癌模型应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学研究领域，具体涉及将绿色荧光蛋白及萤火虫萤光素酶导入细胞，建立表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株及在癌模型应用，用于胃癌基础及临床前研究。

背景技术

根据世界卫生组织2008年统计，胃癌是仅次于肺癌的常见恶性肿瘤。而我国是胃癌的高发区，据统计，每年胃癌新发高达40余万人，死亡人数近30万，为世界首位。在卫生部1990~1992年的全国第二次死因调查中，胃癌约占到所有癌症死亡人数的四分之一。胃癌已日益成为影响人们健康的重大疾病，同时也为社会带来了严重的经济复负担。近年来，随着各国政府对胃癌的重视，胃癌的治疗和基础研究得到了很大的发展，新兴药品和治疗手段不断涌现，但各种治疗效果均有限，胃癌的死亡率和复发率仍依旧很高。因此，深入研究胃癌发生发展的机制，为胃癌治疗开辟新手段，为胃癌诊断创造新思路，具有重大的现实意义。而胃癌的研究必须基于可靠、优良的生物研究平台和方式，然而，目前国内外缺乏一种有效可靠的体外、体内胃癌研究平台，严重制约了胃癌的基础及临床前研究。

慢病毒感染较其他转染方式有较强的优势，具有感染谱广、效率高，可感染非分裂细胞、并可使目的基因整合至基因组因而能够长期表达、免疫反应小等特点，是一种高效的基因转移工具。

绿色荧光蛋白作为一种常见的报告基因已广泛用于生命科学研究领域，它相比于其他标记物有其独特的优点：① 荧光稳定。绿色荧光蛋白对光漂白有较强的耐受性，能耐受长时间的光照；绿色荧光蛋白在pH7～12范围内也能正常发光，且对高温（70℃）、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶（链霉蛋白酶Pronase除外）都有较强抗性。②检测方便，简单直观。用荧光显微镜或肉眼就可以观察到，且可进行活体观察，不会损伤正在生长的细胞和组织。③对受体细胞基本无毒害。④不需任何反应底物和辅助因子。⑤可制成永久标本。可耐受福尔马林的固定，因而可制成长期保存的标本。但是绿色荧光蛋白也有其缺陷：① 需要激发光。在激发绿色荧光蛋白产生荧光的过程中，生物体内很多物质也会发出荧光，产生的非特异性荧光会影响到检测灵敏度。②绿色荧光蛋白发射波长局限于510nm左右，当发光部位深藏于组织中时，由于组织的吸收，绿色荧光很难透过组织。

基于萤火虫荧光素酶的生物发光是近些年出现的成像方法，有别于其他光学成像方法，其特点在于①不需要激发光。因为生物发光采用的是底物发光的形式，因此不需要激发光。②高灵敏度，虽然生物发光强度弱于荧光，但是由于不需要激发光，组织自发荧光少，因而信噪比高，灵敏度高。③穿透力强。由于萤火虫荧光素酶发出的光在540~600nm，组织吸收少，因此对有深部组织成像具有较高的优势。④良好的相关性。光的强度与标记细胞的数目线性相关。其缺点在于，检测不方便，需要底物；并且由于空间分辨率低及检测方式点的限制，因而无法观察细胞的形态。

因此，通过慢病毒转染的方式将绿色荧光蛋白和荧光素酶基因导入胃癌细胞，便可充分利用荧光和生物发光在成像上的优势，因而方便胃癌的基础和临床前研究。

发明内容

本发明的目的是提供人胃癌双标细胞株的建立及应用，它通过慢病毒基因感染的方法，建立表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株及在癌模型应用，用于在胃癌临床前研究中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株，其特征是：以人胃癌细胞系为母细胞，采用慢病毒感染的方法，将绿色荧光蛋白（GFP） 和萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase, LUC）带入细胞，得到稳定表达绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶的细胞株。

将所述的细胞株通过皮下，尾静脉及原位注射的方式建立不同的胃癌动物模型。

所述的慢病毒感染的方法是将外源基因导入，它的步骤是：

a) 大肠杆菌扩增慢病毒包装质粒pWPT-GFP，pMD2.G，pSPAX2, pLenti-CMV-puro-LUC, VSVg，pCMV-dR8.91，并酶切鉴定，纯化；

b) 用上述纯化获得的质粒按照一定比例，用脂质体法共转染入293T细胞，以分别产生含有绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶慢病毒颗粒的上清；

c) 以胃癌SGC7901为母细胞（亦可以其他胃癌细胞株为母细胞），用上述病毒顺次感染；

d) 扩增建系，并通过流式细胞分选技术及嘌呤霉素药物加压筛选技术，获得稳定表达绿色荧光蛋白和荧光素酶的阳性克隆。

所述的绿色荧光蛋白GFP及萤火虫荧光素酶 Firefly luciferase的测手段均为光学信号检测方法，其中包括：