[发明专利]一株产庆大霉素C1a的工程菌及其应用

说明书

技术领域

    本发明属于抗生素制药领域，涉及一种工程菌的构建及其应用，具体地说，本发明涉及一株产庆大霉素C1a工程菌，应用于抗生素制造。

背景技术

小单孢菌可产生丰富的次级代谢产物，特别是氨基糖苷类抗生素，如庆大霉素、西索米星和福提米星等。这些小单孢菌分布奇特，生长缓慢且细胞壁结构特殊，故研究进展缓慢。此外，由于缺乏通用的基因操作系统，小单孢菌遗传操作困难，使得对其分子生物学的研究也大大落后于链霉菌。

小单孢菌是庆大霉素产生菌，庆大霉素是氨基糖苷类抗生素，已在临床上应用了近半个世纪，是我国、乃至全世界抗感染必备的基本药物。庆大霉素属多组分代谢产物，起抗菌作用的主要组分为C族复合物：C1、C2和C1a。庆大霉素产生菌代谢产物可开发的组分十分丰富，如庆大霉素C1a是合成抗耐药菌药物依替米星（Etimicin）的前体；庆大霉素B是进一步合成抗耐药菌药物异帕米星的母体；庆大霉素A、B、X是进一步开发抗原虫的良好药物；最新研究发现氨基糖苷类抗生素还具有抗HIV等功效。因此对该类稀有药用微生物进行深入研究，特别是分子遗传学方面的研究，具有极大意义。

尽管人们对小单孢菌和庆大霉素的研究已近五十年，也取得了一些可喜的成果，但一直未有重大的突破。青霉素在五十余年的研究开发过程中，效价提高了近万倍，而庆大霉素仅提高了几十倍，差别非常悬殊。二十世纪八十年代兴起的链霉菌基因工程，已在抗生素生物合成基因的克隆、产量提高、组分改善及杂合抗生素生产等方面取得了一定的进展，但在小单孢菌中的应用进展缓慢。

依替米星是新型半合成庆大霉素，是中国独创的抗生素一类新药，已在多国申请专利，其知识产权得到了有效保护，需求量大，是本类抗生素临床首选药物。

但由于合成依替米星的母体是庆大霉素C1a（图1）。而庆大霉素C1a需要从庆大霉素产生菌的代谢产物中分离才能得到。不幸的是，到目前为止，所有庆大霉素产生菌的代谢产物是复合物，主要包括庆大霉素C1、C2和C1a等。这些复合物化学结构相近，理化性质相似，从中分离单组份庆大霉素C1a非常困难，导致庆大霉素C1a供不应求，且生产成本居高不下，层析分离周期长，收率低，料耗大，污染严重，提取精制工艺复杂，而且产品质量不稳定，与庆大霉素C1a结构相似的副产物随时出现干扰，给依替米星产品质量控制造成了极大的不确定性，严重影响了药品的稳定性、安全性和有效性，是迫切需要解决的科学难题。

若能获得专一性庆大霉素C1a产生菌，则以上所有问题将迎刃而解，其所带来的经济效益，社会效益和环境效益等是极其巨大的，更重要的是给清洁生产，安全用药，提供了可靠保障。

发明内容

    本发明的目的在于提供一株产庆大霉素C1a的工程菌。

该工程菌为灭活gntK功能的绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea) GK1101菌株，已于2011年9月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 5245。

所述的工程菌的发酵方法，具体如下：菌株GK1101发酵前先用稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落后，再转接于斜面培养基，37℃培养10天，挖块接种于种子培养基，37℃摇床培养28 h，转速为280rpm，然后按10%接种量转接于发酵培养基，37℃摇床培养124 h，转速为280rpm；所述种子培养基：葡萄糖0.1-1.0%，玉米淀粉1.0-2.0%，玉米粉0.5-2.5%，蛋白胨0.1-0.8%，黄豆饼粉0.5-1.5%，KNO₃ 0.05-0.10%，CaCO₃ 0.1-0.5%，pH6.5-7.5，发酵培养基：玉米淀粉3.0-6.0%，玉米粉1.0-2.0%，蛋白胨0.1-0.8%，黄豆饼粉1.0-4.0 %，KNO₃ 0.01-0.10%，(NH₄)₂SO₄ 0.1-0.5%，CaCO₃ 0.1-0.5%，淀粉酶0.001-0.025%，pH6.5-7.5。

所述的工程菌在制备抗菌药物中的应用。

菌株GK1101的筛选，主要包括以下几个步骤：

A.      gntK基因置换质粒的构建；

B.      置换质粒转化绛红色小单孢菌；

C.      转化子的筛选；

D.     工程菌组分的鉴定。