[发明专利]一种有关肺癌诊断试剂盒用于肺癌的检测方法

说明书

[技术领域]

本发明涉及生物技术和医学领域，具体是一种有关肺癌诊断试剂盒用于肺癌的检测方法。 

[背景技术]

肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，也是全球发病率和死亡率增加最快的肿瘤。在全球范围内，肺癌在男性常见肿瘤中居首位，在女性常见肿瘤中居于二、三位。每年大概有120万患者被诊断为肺癌，110万人死于肺癌。肺癌依据其组织病理学可分为两大类：小细胞肺癌和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌又包含鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等。迄今为止，全球的肺癌筛查方案尚不成熟。因此，早期筛查和诊断己经成为肺癌防治急需解决的重大科学问题。肿瘤标志物的发现和合理应用是肿瘤早期发现及其个体化治疗的前提。 

目前有关肺癌的发病机制尚不清楚，研究显示直接从蛋白质整体水平入手来研究肺癌将有可能寻找出更合适的肺癌诊断的分子标志物，为肺癌的诊断预防和治疗提供依据。钙结合蛋白为低分子量酸性蛋白，有17个家族成员。其中S100家族有13个。在S100蛋白家族中，与肿瘤相关的有S100A2、S100A4、S100A6和S100B。最初研究认为S100A2是S100蛋白家族中唯一与肿瘤生成呈负相关的蛋白，由于它在某些肿瘤组织和细胞中表达水平低或缺失，故被称为抑癌基因。而近来也有报道在宫颈癌、胰腺癌、食管癌和肺癌中检测到S100A2表达增高，并与肿瘤的进展和预后有关。 

总之，已知S100A2在某些肿瘤中表达有差异，其在不同肿瘤中的发生、发展和转移等作用方面也有所不同，并且目前仍存在一些争议。因此，深入研究S100A2与肺癌发生、发展和转移的相关性，并揭示其临床价值具有重要意义。本发明在前期研究基础上开发出可供临床应用的检测试剂，以深入地研究和大规模验证S100A2与肺癌的相关性，对癌症进行诊断及为个体患者提供更好的辅助治疗方法。 

[发明内容]

本发明的目的是提供一种用含有S100A2的试剂盒来检测肺癌的方法。 

为实现上述目的设计一种有关肺癌诊断试剂盒用于肺癌的检测方法，包括试剂盒、S100A2蛋白，其特征在于该方法包括以下步骤： 

(1)肺癌诊断试剂盒设有若干个容器或液态芯片和标签，所述的容器容器或液态芯片中分别设有 

a、S100A2蛋白的特异性抗体；和 

b、PBS缓冲液pH7.2-7.4，或0.01mol柠檬酸钠缓冲液pH6.0，或3％H2O2溶液，或辣根酶检测试剂； 

(2)重组蛋白制备，扩增S100A2的核苷酸序列，或用含有该核苷的重组表达载体转化或转导至合适的宿主细胞； 

(3)在合适的培养基中培养宿主细胞； 

(4)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质； 

(5)纯化的S100A2基因产物或者其具有抗原性的片段，注射于动物体内以诱导多克隆抗体制备的产生，同时特异性结合S100A2蛋白的抗体； 

(6)免疫组化：(a)脱蜡和水化：取5μm的石蜡切片于二甲苯中30min， 脱蜡；然后通过一系列不同级别的乙醇浸泡至水化；(b)抗原修复：将切片置于10mM pH6.0柠檬酸缓冲液(pH6.0)中，微波炉加热15min；(c)微波处理后的切片仍置于柠檬酸缓冲液中15min，然后用流动的水冲洗5min；(d)将切片放置于3％H2O2室温孵育15min，以消除内源性过氧化物酶的活性；(e)切片置于1/500稀释的S100A2兔多克隆抗体中温育60min；(f)然后通过免疫组化辣根酶系统的DAB(二氨基联苯胺)底物染色；(g)切片用苏木精复染，然后通过一系列不同级别的乙醇浸泡至二甲苯，处理完的切片，镜检，实验中以水或缓冲液代替多克隆抗体做阴性对照，以S100A2过表达的标本为阳性对照，最后完成检测。 

重组蛋白制备S100A2的编码序列通过RT-PCR获得，引物分别是：S100A2-F：5-GGATCC GAACTTCTGCACAAGG-3’和S100A2-R：5’-CCGCTCGAGAAAGGCATCAACAGTC-3’，模板用的是肺癌组织cDNA。获得的DNA片段经限制性内切酶BamHI/XohI双酶切后插入经BamHI/XohI双酶切的pGEX-4T-1中，构建重组质粒pGEX-4T-1-S100A2。转化重组质粒到BL21(DE3)中诱导表达，诱导表达的S100A2重组蛋白经过纯化，并通过SDS-PAGE检测。