[发明专利]基于功能化纳米金电极的快速检测菌落总数的方法

权利要求书

1. 一种基于功能化纳米金电极的快速检测菌落总数的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）制备功能化纳米金电极：以pH为7的磷酸盐缓冲溶液为修饰液，通过控制电位电解的方法在金电极上施加1.8-2.2V恒电位下电解修饰480～600s，形成金电极表面纳米功能化处理的功能化纳米金电极；

（2）获得标准曲线：对已知浓度的标准样品用计时电流法进行测定，得到电流响应和牛奶中细菌数量的对应关系，根据电流响应和牛奶中细菌数量的对应关系以细菌浓度为横坐标，以电流响应值为纵坐标，建立细菌浓度-响应电流标准曲线；

（3）以步骤（2）获得的细菌浓度-响应电流标准曲线为参照，通过使用功能化纳米金电极为工作电极的检测器用计时电流法测定待测样品的电流响应值，根据步骤（2）获得的细菌浓度-响应电流标准曲线获得待测样品的每毫升样品细菌总数。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步骤（2）还包括对获得的细菌浓度-响应电流标准曲线进行验证的步骤；所述对获得的细菌浓度-响应电流标准曲线进行验证的方法包括在对已知浓度的标准样品用计时电流法进行测定的同时通过标准平板计数法对同一标准样品进行测定，得到电流响应和牛奶中细菌数量的对应关系，根据电流响应和牛奶中细菌数量的对应关系对建立的细菌浓度-响应电流标准曲线进行校正得到校正后的细菌浓度-响应电流标准曲线。

3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法步骤（2）最后得到的细菌浓度-响应电流标准曲线为一直线，对该细菌浓度-响应电流标准曲线进行拟合得到响应电流与细菌浓度的关系公式为：ΔI= k*C，其中，ΔI为样品产生的电流与空白值电流的差值，单位为微安（μA）；k为常数，C为细菌浓度，单位为细菌数/毫升（cfu·mL^-1）。

4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法步骤（1）中金电极进行电解修饰前需要进行抛光清洗处理，其工序包括依次用0.3μm和0.05μm的A1₂O₃粉在绒布上对金电极进行抛光，然后用二次蒸馏水冲洗，依次在HNO₃溶液、无水乙醇及二次蒸馏水中超声波清洗处理，清洗后的金电极烘干备用。

5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法步骤（1）制备的功能化纳米金电极在进行使用前需要在0V～1.5V的范围内循环伏安扫描至电流稳定，完成后用二次蒸馏水反复冲洗，储存在二次蒸馏水中待用。

6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法步骤（2）对已知浓度的标准样品进行测定的工作条件是：以功能化纳米金修饰电极为工作电极，铂电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，以经高压灭菌的0.05～0.15mol·L^-1、pH6.8～7.40 的磷酸缓冲溶液为电解质，工作电压为0.8～1.2V，测定时将电解池置于30～40℃的恒温水浴中，待基线电流稳定后，用无菌微量注射器将已知细菌浓度的菌悬液连续加入检测池中进行测定。

7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法步骤（3）的检测条件与步骤（2）的条件相同，等基线电流稳定后，用微量注射器连续加入10～20μL时待测样品进行检测。