[发明专利]水稻抗稻瘟病基因Pi‑y43(t)及其相关SSR标记

说明书

技术领域

本发明涉及粳稻云引的稻瘟病抗性基因Pi-y43(t)及其相关的5对SSR多态性标记，该基因是在对稻瘟病广谱抗性品种云引的稻瘟病抗性基因Pi-y43(t)进行精细定位和图位克隆的基础上获得的，与已知的抗性基因Pib相比，含有Pi-y43(t)的云引高抗“四川-43”稻瘟病菌株，而含Pib基因的单基因鉴别系对“四川-43”表现为中抗。 

发明背景 

稻瘟病是由真菌(Magnaporthe oryzae)引起的广泛发生在世界各稻区最严重的病害之一。每年水稻由于稻瘟病导致的损失，约占总产量的10％～15％，损失达数十亿美元。目前控制稻瘟病流行的方式主要是使用农药进行化学防治和培育抗稻瘟病的水稻新品种。农药对环境的危害很大，容易造成环境污染，而且增加了水稻种植生产的成本。由于稻瘟病菌生理小种对抗病水稻品种的适应性选择，导致稻瘟病菌的生理小种发生改变，单个抗性位点的水稻品种往往在种植若干年后即丧失抗性。1981年福建省大面积种植的水稻品种“红 410”稻瘟病抗性丧失，使当年早季稻瘟病大爆发，失收水稻面积达543.2万hm²，损失高达数十亿公斤的稻谷。一般认为选育广谱持久抗病且具有多个抗病基因的水稻新品种是解决抗病水稻品种快速感病的有效途径之一。 

为提高水稻品种的稻瘟病抗性持久性，通过含有不同抗病位点基因的品种间杂交，聚合多个抗病基因，从而获得广谱持久抗病的水稻新品种。传统方法中通过苗期的抗性鉴定很难筛选到含多个抗病基因的株系，包含单一抗性位点的植物具有完全抗性就无法与含有多个抗病基因的植株区分开，结果筛选得到的抗病株系无法区分是否含有多个抗性位点。利用与抗病基因紧密连锁的分子标记进行辅助筛选，能够克服依赖于苗期抗性鉴定的不足，该方法已经成功用于稻瘟病抗性多基因的聚合。 

粳稻云引对福建省和四川省两省的大部分稻瘟病优势菌株具有较好的抗性，充分挖掘云引中的稻瘟病抗性基因，寻找云引中与稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记，利用传统育种技术与现代分子生物学技术相结合，通过基因的聚合，导入到其它优良水稻新品种中。 

基于表型鉴定结果的分子标记方法，通过分离群体分析法(BSA)和隐性群体分析法(RCA)，对云引的稻瘟病抗性基因Pi-y43(t)进行精细定位，为实现这一目标，本发明开发了5对具有良好多态性的SSR分子标记，最终将该基因定位在0.64cM区域范围。在对目标基因区域进行了基因预测注释及表达模式分析之后，初步确定了Piy43-3为本研究的唯一候选基因，并通过分段克隆测序拼接法及结合LR-PCR技术对候选基因进行了扩增，克隆获得Pi-y43(t)。实现了Pi-y43(t)的精细定位，并获得了与Pi-y43(t)紧密连锁的分子标记，为分子标记辅助育种奠定基础。 

发明内容

本发明的目的在于挖掘稻瘟病广谱抗性品种云引中的稻瘟病抗性基因，寻找云引中与稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记，服务于分子标记辅助育种。 

附图说明

图1RM14166在两亲本、抗感基因池及F₂极端感病个性的检测。P₁：云引；P₂：丽江新团黑谷；Rp：抗病池；Sp：感病池；1-40：极端感病个体；37：重组单株 

图2Pi-y43(t)基因区域的物理重叠群 

图3云引稻瘟病抗性基因Pi-y43(t)遗传连锁图(cM) 

图4云引稻瘟病抗性基因Pi-y43(t)物理图 

图5Pi-y43(t)目标区域的基因预测 

图6ACTIN检测反转的cDNA质量。M：DL2000；1-4：云引0h、24h、48h、72h样品；5-8：LTH 0h、24h、48h、72h样品；9：云引基因组DNA；10：LTH基因组DNA 

图7Piy43-3 RT-PCR分析。M：标准分子量DL2000；1-4：云引0h、24h、48h、72h样品；5-8：LTH 0h、24h、48h、72h样品 

图8Piy43-3cDNA的扩增。M：DL5000，1为68℃扩增结果 

图9以云引DNA为模板扩增Pi-y43(t)基因 

图10注射接种“四川-43”菌株鉴定云引及Pib单基因系。LTH：丽江新团黑谷；Npb：日本晴；YY：云引；IRBLb-B、IRBL14：Pib单基因系