[发明专利]具有STED片光源的SPIM显微镜

说明书

技术领域

本发明涉及包括光源和照相机的SPIM显微镜，所述光源从y方向发出激发光束到要成像的对象上，所述照相机以z方向作为第一检测方向检测从所述对象上发出的荧光和/或反射光，其中z方向沿基本与y方向垂直的方向延伸。

背景技术

特别地，对生物样品的分析应是快速且不应对生物样品造成损伤。对很多应用来说，生成三维图像很有用。应该避免因照射光与样品的相互作用而发生的散射伪像和吸收伪像，特别是在荧光显微镜的视场下时，其中照射光具有用于激发荧光的激发光功能。

所谓的SPIM(选择性平面照射显微镜)技术特别适合于以高分辨率实现快速分析显微样品，且不损伤样品，其中照射光产生片光源(light sheet)，同时照相机在相对于照射方向相垂直的方向上检测由荧光和反射产生的检测光。

片光源为具有大体矩形截面的照射体积，其在第一截面方向上(此处为z方向)非常薄，而相对于第一截面方向，第二截面方向上(此处为x方向)明显更厚。照射方向(此处为y方向)基本垂直于第一截面方向(此处为z方向)延伸，且沿与第二截面方向(此处为x方向)基本垂直的方向延伸。片光源由圆柱状透镜聚焦且该片光源的焦距或焦长可被理解为照射方向(此处为y方向)上的特定范围，其中片光源特别薄，使得被照射体积的形状为片状，即在z方向上非常薄而在x和y方向上较厚。

根据现有SPIM技术，利用圆柱状透镜产生的片光源的缺点在于，该系统很不灵活，例如其提供的是固定焦点，因此被照射体积是预确定的。为了实现高分辨率，尽可能薄且纵向延伸的焦距是有益的。可以在样品的一个方向上扫描该焦距以获得三维图像。由于长度增加也使宽度增加，z方向上的分辨率就降低了。这意味虽然选择了较低的照射光学器件的数值孔径而得到了长焦距，但结果也会使被照射体积的厚度较大。这意味着检测方向上沿光轴的光学分辨率也同样降低。根据实际应用，结果与目标却相互矛盾：如果应该使照射光穿透的深度大，那么就需要焦距长，然而焦距长又导致片光源更厚从而降低分辨率。照射光学器件的数值孔径小，所形成的焦距长。

除期望在照射光的穿透深度大的同时还能实现高分辨率，通常还期望能在照射体积上有灵活性。例如，一些应用要求照射体积更大，比如在需要观察发生在特定体积的对象内的化学反应时。相对而言，也有可能期望照射体积更小，例如特别是在通过更薄的片光源实现更薄的照射体积以使其具有更明确限定的层或平面从而用于例如确定对象内的扩散速度时。

发明内容

本发明的目的是首先提高被描述显微镜的灵活性，尤其提高在选择照射体积上的灵活性以及提高在选择显微镜类型上的灵活性。

根据本发明，上述目的通过第一x扫描仪实现，该扫描仪通过在x方向上扫描照明光束产生连续片光源，其中x方向沿与y方向和z方向基本垂直的方向延伸，且片光源在由x方向与y方向所限定的平面内连续形成；并且去活化光源从y方向发出至少一个去活化光束至物体上，使连续产生的片光源在z方向上更薄，其中去活化光束具有在z方向上相对于照明光束偏移的至少一个强度最大值，且去活化光束平行于照明光束在x方向上被扫描。

根据本发明的优选实施例，提供去活化光束调制器，其适于调制去活化光束，使得去活化光束的截面包括在z方向上的至少两个强度最大值，其中在强度最大值之间具有零点，该零点位于激发光束中心处。在可替代方案中，该去活化光束可被调制为使去活化光束的旁瓣(侧极值)也被去活化。在该情况下，如果激发光束的旁瓣与去活化光束的峰值相重合是有益的。可以调制激发光束使产生的旁瓣更强，这将使最大值更长、更细。在非去活化的情况下更强的旁瓣(侧极值)降低了z方向上的分辨率。然而如果侧最大值被去活化，就提高了分辨率。

另外，可变化地选择使用短TAG透镜中的“可调声梯度折射率指数透镜”来调制激励光束。该TAG透镜提供了一种用于产生贝塞尔光束的替代方法。在该TAG透镜中，在圆形压电元件中提供光折射流体，该流体被交流电激励从而产生变化的折射率。激励信号在振幅及频率上的变化使传输的图案发生快速改变。切换速率由允许形成稳定图案的切换动作间所需的时间来确定-这主要取决于流体的粘度。对于粘度在640cs和0.65cs之间的流体，切换时间可以为300和2000μs之间。