[发明专利]一种检测病毒的方法

权利要求书

1.一种检测病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

使用病毒特异性扩增引物对所述病毒的核酸进行PCR扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物中包含所述病毒的变异位点；

以所述扩增产物为模板，使用延伸引物进行延伸反应，以便获得在所述延伸引物的3’端连接一个碱基的延伸产物，其中，所述延伸引物的3’端紧邻所述变异位点；以及

将所述延伸产物进行基质辅助激光吸附/电离飞行时间质谱系统检测，以便确定所述病毒的类型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒为人类乳头瘤病毒，其中，通过将所述延伸产物进行基质辅助激光吸附/电离飞行时间质谱系统检测，以便确定所述人类乳头瘤病毒的基因型，所述基因型优选为HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68和HPV73中的一种或几种。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)根据所选择的待检测HPV基因型别通用引物序列的变异位点，修改GP5+/GP6+通用引物，设计出针对每型的扩增引物，在每一特异型别的扩增引物3’位置有12个碱基的完全匹配，且该扩增引物均带了10个碱基acgttggatg的标签序列；设计延伸引物，延伸引物的长度为17-28碱基，在延伸引物的3’端末位包括延伸碱基在内的4个碱基中，包含一个型特异多态位点标记；延伸引物选择的位置是GP5+/GP6+序列中相对保守的区域；

(2)通过PCR扩增，获得含有所述突变位点的靶序列扩增产物；

(3)通过SAP酶处理，除去所述扩增产物中含有的dNTPs；

(4)通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，得到的延伸产物与所述延伸引物之间分子量差异不小于9D，且各个型别的延伸产物间的分子量差异不小于9D；

(5)采用树脂纯化延伸反应产物；

(6)将纯化后的产物采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统进行质谱检测，确定待检测HPV基因型别。

4.如权利要求3所述检测人类乳头瘤病毒基因型的方法，其特征在于，所述步骤(1)中待检测HPV基因型别的相应扩增引物的序列为：

延伸引物序列为：

。

5.如权利要求3所述检测人类乳头瘤病毒基因型的方法，其特征在于，所述步骤(1)中以β-球蛋白基因作为内部参照基因，采用的扩增引物序列为SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.24，延伸引物序列为SEQ ID NO.42。

6.如权利要求3或4所述检测人类乳头瘤病毒基因型的方法，其特征在于，所述扩增引物为PAGE纯化，所述延伸引物为HPLC纯化。

7.如权利要求3所述检测人类乳头瘤病毒基因型的方法，其特征在于，还包括在反应中加入阳性对照和阴性对照，所述阳性对照HPV18重组质粒，并掺入经检测无HPV感染人基因组DNA背景，所述阴性对照为无菌双蒸水和鼠肝DNA。

8.如权利要求3所述检测人类乳头瘤病毒基因型的方法，其特征在于，还包括HPV质粒标准品的制备步骤，以及采用该标准品对引物特异性和灵敏度进行测试的步骤，所述HPV质粒标准品为插入人类乳头瘤病毒MY09/MY11序列的PMD质粒。