[发明专利]一种分离牛外周血单核细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞分离技术，具体地说，涉及一种分离牛外周血单核细胞的方法。

背景技术

分离外周血单核细胞一般包括两个步骤：即外周血单个核细胞的分离和后续单核细胞的分离。其中，第一步是通过密度梯度离心完成的，通过选择一定密度的分离液，可以将血液中密度较低的单核细胞和淋巴细胞(二者密度相近，合称外周血单个核细胞，PBMC)与密度较高的粒细胞、红细胞成分分开；第二步，单核细胞可以用其它一些方法与淋巴细胞分离开，包括吸附法、免疫分选、反向淘选离心法和密度梯度分离等。其中，吸附法是最常用的方法，它简单、经济，但是也存在一些缺点，比如淋巴细胞污染量高、灵活性低、工作量大、单核细胞激活等。免疫分选对于日常应用以及处理大量血液样本而言十分昂贵，需要专门的单克隆抗体和设备，一般包括流式细胞术和免疫磁珠两种方法。反向淘选离心法可以处理大量的血液，纯度高活率高，而且不易激活单核细胞，但是需要昂贵的设备和专业的技术人员。密度分离的方法包括使用连续密度梯度和非连续密度梯度两种，其中制作连续密度梯度的泵和超速离心机价格相对昂贵。

1999年，Jindrich Soltys等人使用了免疫磁珠的方法分离牛的中性粒细胞，细胞得率更高、纯度更纯，而且在诸多检测指标中都表现出了更好的活性，但是用免疫磁珠法分离牛外周血单核细胞还未有文献报道。使用抗体的单核细胞分离技术还有流式细胞术，但是也没有用于分离牛外周血单核细胞的文献报道。反向离心淘洗法需要一套专门的反向离心淘洗设备，用于人的外周血单核细胞分离，但也没有文献使用了该技术分离牛的外周血单核细胞。密度分离的方法是基于单核细胞和淋巴细胞的大小不同，使用连续密度梯度分离液和超速离心机将二者分开，目前该方法也不常用牛的外周血单核细胞分离。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，对塑料吸附法分离牛外周血单核细胞的关键步骤进行改进，提供一种优化的分离牛外周血单核细胞的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种分离牛外周血单核细胞的方法，包括步骤：1)向含有抗凝剂ACD-A的离心管中加入采集到的牛外周血，制成抗凝血液；2)将OptiPrep^TM原液与C液按比例混合，制成密度分离液；3)将1)的抗凝血液与PBS液按比例混合，制成稀释的抗凝血液；4)将2份体积的3)稀释的抗凝血液加在1份体积的2)的密度分离液之上，离心，弃上清，将分离液和血清液面交界处的白色薄层转移至另一离心管中；5)向4)的离心管中加入PBS溶液清洗细胞，然后以转速250g离心5-10min；重复5)一次；6)向5)的细胞沉淀中加入PBS溶液重悬，即得单个核细胞。

其中，前述2)和3)中C液的制备方法为：将1.79g Tricine Buffer加入100ml水中，制得100mM Tricine储存液，4℃保存；将0.85g NaCl加入50ml水中，加入20ml 100mM Tricine储存液，用1M NaOH调节pH值7.4，加水补充体积至100ml，0.22μm滤器过滤除菌。

前述步骤1)中所述的抗凝剂ACD-A的制备方法为：向100ml水中加入0.73g无水柠檬酸、2.20g二水柠檬酸钠和2.45g一水右旋糖，调节pH值至7.0-7.3，0.22μm滤器过滤除菌。其中，抗凝剂ACD-A和牛外周血的体积比为1∶5-10。

前述步骤2)中OptiPrep^TM原液与C液的体积比为1.4∶4.6。

前述步骤3)中抗凝血液与PBS液的体积比为1∶1。

前述的方法还包括以下步骤：将6)的细胞悬液转移至细胞培养瓶中，加入RPMI1640培养基，然后将细胞培养瓶置于37℃，5％CO₂的条件下培养，得到贴壁的单核细胞。

本发明采用了新型的密度梯度分离液OptiPrep^TM，它是一种非离子型等渗造影剂，可以配置的密度范围宽，而且它不像Percoll^TM含有固态颗粒，后者可能会被单核细胞吞噬，而且内毒素含量很低(高浓度Ficoll^TM可能含有较高的内毒素含量)，对敏感的单核细胞损伤和影响很小。本发明是以OptiPrep^TM说明书为基础，参考了其它关于牛和人的单核细胞分离技术的文献，经过反复实验和不断摸索而设计得到的，将说明书和部分文献中对实验有利的步骤保留，剔除不利的步骤。