[发明专利]两核苷酸同时合成DNA测序方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，是一种实现核酸序列高通量测定的方法，具体涉及一种两核苷酸同时合成的编码、解码核酸序列测定方法及其应用。

背景技术

随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。就基因序列分析而言，后基因时代的重点已由全基因组序列测定转移到了对基因组中个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。目前，无论是找寻新的还是确认已知SNP位点，传统的SangerDNA测序法，仍处于无可替代的地位。但这一方法存在通量低和价格高的问题。第一个人类基因组序列测定的费用大约为10亿美元，虽然目前这一费用已经大大降低，但功能基因组的研究进展仍然受限于DNA测序技术。为此，美国Venter基金会在2003年提出了1000美金人类全基因组测序的研究目标。美国国立卫生研究院人类基因组研究中心主任Collins教授指出：大幅度降低DNA测序的成本将会大大推动生命科学和医学的研究，甚至会带来革命性的变化。目前，全基因组DNA测序技术已经成为国际上一个竞争十分激烈的研究领域。如Roche公司基于乳液PCR产物的高通量并行焦测序技术；Illumina公司的桥式扩增-DNA芯片延伸测序技术；以及Applied Biosestems公司基于乳液PCR产物的杂交-酶连接-酶切割的SOLiD平台、pH敏感场效应管阵列芯片的Ion Torrent平台等高通量测序技术都有成熟的商品化仪器上市。

聚合酶链式反应(PCR)表明合成延伸反应理论上合成测序方法可以测定数千甚至上万个碱基，这无疑代表高通量核酸测序的巨大潜力。然而现有的合成测序要么是简单地每次只加一种核苷酸的方法通过确定每次合成的碱基的个数，或者通过可逆封闭核苷酸单体3端羟基的特殊单体一次只延伸一个核苷酸的方法确定每次合成的碱基种类的来实现的。前者，要么每个模板需要独立的“反应池”而使得测序通量大大降低，要么是需要四个独立的反应来完成所有模板的一个碱基的测定而增加测序时间；后者由于在测定下一个碱基前需要将3端羟基的保护基团脱出，而每增加一步反应将导致反应效率的降低，最终导致测序长度的下降。

本发明的目的就是通过一种两核苷酸同时合成的编码、解码核酸序列的测定方法，每组测序由包含四个标记的核苷酸A、G、C、T，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行两次由两个不同标记核苷酸同时合成测序反应的循环，每进行一次合成测序反应得到由核酸片段构成的一个编码，核酸片段的编码按照核苷酸的标记物和标记物的强度进行，一个序列片段对应一个编码，并用一个专属的符号表示，编码包括单个标记物对应的单个碱基字符、由两个不同标记物构成的两个碱基字符串，称之为母码，表示标记物或者碱基的种类码；以及由标记物强度反映的核苷酸个数构成，称之为子码，表示标记物强度对应的碱基个数码；若干次测序反应后得到由编码构成的核酸序列信息。当该组测序反应完成后，通过变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行下一组测序反应；最后将三组测序反应获得的三组编码信息，通过解码转化成三组核酸片段信息，并通过比较三组核酸片段信息组装出待测核酸序列的具体碱基信息。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是提供一种基于两种3’端羟基非封闭核苷酸的同时合成测序方法来实现核酸序列的高通量测定，本发明有助于降低测定成本，具有方法简单的优点。