[发明专利]菲律宾蛤仔防御素Defensin A基因及其重组蛋白和应用

说明书

技术领域

本发明涉及抗菌肽，具体涉及一种菲律宾蛤仔防御素Defensin A基因及其重组蛋白、以及构建方法和应用。 

背景技术

抗菌肽是生物体产生的一类由20-60个氨基酸组成的多肽，对真菌、细菌等病原微生物具有抑制或杀灭作用，通常被称为“第二防御体系”。根据抗菌肽结构和三维构象的差异，可将抗菌肽分为以下四类：(1)具有α螺旋结构的线性肽，如蜂毒肽、蛙皮肽、天蚕抗菌肽等；(2)含有二硫键的β折叠结构，如防御素、昆虫防御肽等；(3)由一种或多种氨基酸为主构成的多肽，如富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等；(4)前体蛋白剪切而来的多肽，如淡水螯虾(Pacifastacus leniusculus)的血蓝蛋白C-端酶解后可产生具有抗菌活性的多肽。这类分子具有一些共同的特点：在生物体内合成迅速；具有广谱抗菌活性，对细菌、真菌、原生动物等有作用，但对真核细胞无毒害；分子量一般在10kDa以下；多数是阳离子分子。抗菌肽的作用机理与传统抗生素不同，它们的靶位点主要是病原体的细胞膜以增加膜的渗透性，因此不易产生抗性。抗菌肽不仅作用于革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌，还可以杀灭真菌、病毒、寄生虫和肿瘤细胞，同时还能加速免疫和伤口愈合过程。由于病原菌对抗生素逐步产生抗药性，抗菌肽为开发新的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景。在海洋贝类中，贻贝的抗菌肽研究较为透彻，根据其一级结构和二硫键形成的不同形式，贻贝抗菌肽又可分为四种类型：防御素(defensins)、贻贝素(mytilins)、贻贝肽(myticins)和贻贝霉素(mytimycins)。目前国内外关于菲律宾蛤仔抗菌肽及其抗菌活性的研究较少。赵建民等利用大肠杆菌原核表达系统，体外重组表达菲律宾蛤仔大防御素(VpBD)蛋白，具有广谱的抗革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌。 

发明内容

本发明目的在于提供一种菲律宾蛤仔防御素Defensin A基因及其重组蛋白、以及构建方法和应用。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 

一种菲律宾蛤仔防御素Defensin A基因：所述防御素Defensin A基因为序列表SEQ ID NO.1中碱基序列所示。 

一种菲律宾蛤仔防御素Defensin A基因重组蛋白：所述防御素Defensin A基因重组蛋白为序列表SEQ ID NO.2中氨基酸序列所示。 

菲律宾蛤仔防御素Defensin A基因重组蛋白的应用：所述防御素 Defensin A基因重组表达产物可制备为抗菌药物、免疫增强剂、饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂。所述防御素Defensin A基因重组表达产物可作为制备革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的抑菌药物。革兰氏阳性菌为巴氏葡萄球菌或金黄色葡萄球菌；革兰氏阴性菌为溶藻弧菌、阴沟肠杆菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌或副溶血弧菌。 

本发明所具有的优点： 

1.本发明从菲律宾蛤仔中克隆到防御素Defensin A的全长cDNA序列，实现其重组表达并测定其抗菌谱和最小抑菌浓度，为菲律宾蛤仔的病害防治、基因辅助选育及进一步开发为医药产品和保鲜防腐剂奠定基础。 

2.与现有技术相比，本发明的防御素Defensin A为菲律宾蛤仔抗菌肽，对海洋来源的多种革兰氏阳性和阴性病原微生物均具有很强的抑制活性，具有开发为广谱抗菌类药物、遗传选育和饲料添加剂等方面的应用价值。 

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。 

本发明菲律宾蛤仔防御素Defensin A的制备方法： 

1)总RNA提取：用Trizol试剂从感染鳗弧菌的菲律宾蛤仔的血淋巴中提取总RNA，存于-80℃备用；提取方法依Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行； 

2)mRNA纯化：用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA；纯化方法依据QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒说明书进行；