[发明专利]测定细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物的液质联用方法

权利要求书

1.一种测定细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物的液质联用方法，其特征在于：首先利用中性红法分析NNK的细胞毒性，选定适宜的染毒范围，在选定的染毒范围内对细胞进行NNK的染毒试验，并对染毒后所得的细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物进行液质联用分析。

2.根据权利要求1所述的测定细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物的液质联用方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

a. 中性红试验：取生长状态良好的细胞，消化计数，按适宜密度接种于96孔板，其中第一列作为空白对照，放入培养箱中培养；24 h后染毒，将第三到八列依次加入不同浓度的NNK染毒液，第二列、第十一列分别加入培养液与十二烷基磺酸钠（SDS）作为阴性与阳性对照，继续培养；24 h后，弃培养液，用PBS漂洗两次，加入已过滤的提前24 h温育的中性红培养液培养3 h；弃培养液，用PBS漂洗两次，加入现配的酸乙醇洗脱液，置于振荡器上震荡混匀20 min，用酶标仪于540 nm处测定吸光度值；

b. NNK的染毒及细胞培养液样品前处理：接种细胞24 h后进行NNK染毒处理，继续培养24 h后取出培养液；

取1 mL培养液置于10 mL离心管，加入内标溶液，加入3 mL乙腈，静置1 h沉淀蛋白，10000 rpm离心10 min，取上清液过0.22 μm有机相滤膜，取200μL滤液于色谱瓶，用流动相混合液定容至1 mL，混匀，进行LC-MS/MS分析测定；

c. NNK的染毒及细胞提取物样品前处理：接种细胞24 h后进行NNK染毒处理，继续培养24 h后取出培养液；

用PBS润洗细胞表面三次，取最后一次的润洗液留作监测；加入胰酶进行消化，离心后弃去上清液，得细胞沉淀，加入生理盐水，反复吹打细胞15-30 min，将混合液移至离心管，再向原管中加入生理盐水润洗，洗液一起并入离心管；向管中加入10-15粒玻璃珠，于涡旋震荡器上涡旋10 s，随即放入冰水中30 s，反复几次，再于14000 rpm，4 ℃离心30 min，取上清液即得细胞提取物；取细胞提取物20 μL，加入60 μL乙腈沉淀蛋白，静置1 h，10000 rpm离心10 min，取上清液；过MEPS针萃取后，进行LC-MS/MS分析测定；

d. 样品分析：

色谱条件：

色谱柱：Agilent ZORBAX HILIC Plus柱；流动相：A：水（含10 mM甲酸铵），B：乙腈；流速：200 μL/min；洗脱方式：等度 15% A+85% B；进样量：2 μL；柱温：26 ℃；

质谱条件：

电离模式：电喷雾电离（ESI）；扫描模式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压（Ion Spray Voltage, IS）：5500 V；离子源温度（TEM）：600 ℃；雾化气（GS1, N₂）：65 psi；辅助加热气（GS2 , N₂）：60 psi；气帘气（Curtain gas, CUR, N₂）：35 psi；碰撞气（Collision gas, CAD, N₂）：8 psi；驻留时间（Dwell Time）：50 ms；入口电压EP（Entrance Potential）：10 V；出口电压CXP（Collision Cell Exit Potential）：12 V。

3.根据权利要求1所述的测定细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物的液质联用方法，其特征在于：所使用的色谱柱为美国Agilent 公司的Agilent ZORBAX HILIC Plus柱，型号为2.1×100 mm, 3.5 μm。

4.根据权利要求1所述的测定细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物的液质联用方法，其特征在于：步骤a中的酸乙醇洗脱液为乙醇+水+冰醋酸，体积比50：49：1。