[发明专利]一种PRP核糖提取方法

权利要求书

1.一种从Hib发酵液中制备B型流感嗜血杆菌PRP多糖的方法，其特征在于，该方法包括：

(1)从B型流感嗜血杆菌发酵液中去除菌体得到发酵液上清；

(2)从发酵液上清中去除核酸和蛋白，得到PRP多糖。

2.根据权利1的方法，其特征在于，步骤(1)得到的发酵液上清可以直接进行步骤(2)，也可以浓缩发酵液上清再进行步骤(2)，还可以过滤发酵液上清，再浓缩再进行步骤(2)。

3.根据权利1的方法，其特征在于，其中步骤(1)采用离心的方法去除菌体。

4.根据权利2的方法，其特征在于，其中步骤(2)所述的浓缩发酵液上清用膜包超滤浓缩。

5.根据权利1的方法，其特征在于，其中步骤(2)采用以阴离子介质装填的色谱柱去除蛋白和核酸类杂质。

6.根据权利5的方法，其特征在于，其中所述的阴离子介质为强阴离子介质Q-sepharose。

7.根据权利6的方法，其特征在于，在采用阴离子介质去除蛋白和核酸类杂质之后，还要进行乙醇分布醇沉纯化的步骤。

8.根据权利7的方法，其特征在于，在进行乙醇分布醇沉纯化的步骤之后，还要进行用凝胶介质进一步分离纯化的步骤。

9.根据权利8的方法，其特征在于，其中所述的凝胶介质是sepharose 4FF。

10.根据权利9的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)去除菌体得到发酵液上清

Hib发酵液8000rpm离心20min去除菌体沉淀得到发酵液上清；

(2)膜包超滤浓缩发酵液上清

发酵液上清过0.22um的中空纤维，滤过液用50KDa的膜包超滤浓缩，通常浓缩后的体积只有初始发酵液上清的二十分之一；

(3)采用阴离子介质去除蛋白和核酸类杂质

浓缩液用Q-sepharose柱进一步纯化，上样前先用4倍柱体积的A液平衡Q-sepharose柱(A液：0.5*PBS)，上样结束后用6倍柱体积的A液继续洗涤Q-sepharose柱，除去大量吸附性较弱以及没有吸附的杂质；

之后先用6倍柱体积的28％的B液洗脱Q-sepharose柱，弃去洗脱液，再用6倍柱体积的100％的B液洗脱Q-sepharose柱，收集洗脱液；

(4)乙醇分步醇沉

洗脱液用乙醇分步醇沉进一步纯化，其中30％乙醇浓度除去蛋白和核酸，80％的乙醇浓度沉淀PRP核糖；离心收集80％醇沉的沉淀，用0.2M NaCl复溶，取溶解上清进行进一步的纯化；

(5)采用凝胶介质进一步分离纯化0.2M NaCl复溶物用sepharose 4FF进一步分离纯化，自动收集器收集洗脱液，采用药典规定的方法确定PRP核糖洗脱曲线，收集合并PRP核糖。