[发明专利]一种通过还原途径积累延胡索酸的酿酒酵母基因工程菌的构建及柠檬酸对其发酵特性的影响

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过还原途径积累延胡索酸的酿酒酵母工程菌的构建方法及柠檬酸的添 加对其发酵特性的影响，属于遗传工程领域和发酵工程领域。

背景技术

作为一类重要的有机酸和最简单的不饱和二羧酸，延胡索酸广泛应用于食品、医药、化 工以及畜牧等行业中，特别是作为聚合反应和酯化反应的良好材料，延胡索酸被称为最引人 瞩目的十二大化工结构元件之一，因此，具有十分广阔的市场和应用前景。石油化工路线 (petrochemical routes)是当前延胡索酸的主要生产方法，该工艺因原料有限、环境污染严重、 生产成本高昂等问题，其产能的进一步扩大受到了限制。利用微生物发酵法生产延胡索酸引 起了广泛的兴趣，目前研究得最多的微生物是米根霉(Rhizopus oryzae)和少根根霉(Rhizopus  arrhizus)。但是，R.oryzae和R.arrhizus表现出复杂的生长形态，发酵工艺难以控制，且其 遗传信息和生化机制研究较少，代谢工程改造十分困难。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 作为一种真核模式微生物，因具有：遗传信息丰富，代谢改造操作方便；营养需求简单，生 化分离工艺成本低廉；在低pH条件(甚至pH＜3.0)下生长良好；能耐受高浓度的底物；被 FDA认证为GRAS(Generally Regarded As Safe)微生物，发酵产品具有安全性等优点而成为 发酵生产延胡索酸的潜在最适微生物。

酿酒酵母本身不具备积累延胡索酸的代谢途径，但研究发现：R.oryzae是通过胞质还原 途径积累大量延胡索酸的，并且，通过该途径积累延胡索酸具有最大的理论得率(2mol/mol  glucose)，还可以通过丙酮酸羧化反应固定二氧化碳。那么，酿酒酵母是否也可以通过胞质还 原途径大量积累延胡索酸并固定二氧化碳，是一个十分令人感兴趣的问题。此外，当胞质还 原途径引入酿酒酵母细胞后，是否导致氧化还原的不平衡及能量的供应不足，也是一个需要 考虑的问题，有报道认为，添加促进NADH合成的底物，如柠檬酸，可以提高胞内ATP的 水平，同时还可以诱导与能量代谢相关的关键酶和酶系的表达，促进胞内ATP的合成。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是通过在酿酒酵母里构建一条胞质还原TCA途径，使得延胡 索酸得以积累，并通过添加柠檬酸来解决能量不足和氧化还原的问题。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

通过在酿酒酵母中过量表达源于Rhizopus oryzae NRRL1526的苹果酸脱氢酶基因 RoMDH和源于自身的丙酮酸羧化酶基因PYC2。并通过添加柠檬酸来解决能量不足和氧化还 原不平衡的问题。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种利用所述工程菌FMME-001-5发酵生产延 胡索酸的方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

1)提取米根霉(Rhizopus oryzae NRRL1526)的总RNA，经反转录后获得其cDNA，然 后以cDNA为模板，PCR扩增获得RoMDH。

2)提取酿酒酵母(S.cerevisiae BMA64)的基因组，以其为模板，PCR扩增获得PYC2。

3)重组质粒的构建：将基因RoMDH连接到质粒pY26TEF/GPD，获得重组质粒 pY26TEF/GPD-RoMDH；将基因PYC2连接到质粒PRS305TEF1，获得重组质粒 pRS305TEF1-PYC2。

4)重组质粒的转化：将上述重组质粒先后转化到处于感受态的酿酒酵母(S.cerevisiae  BMA64)细胞，通过筛选平板获得阳性转化子。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种利用所述工程菌发酵生产延胡索酸的方法。 将30℃、200rpm下培养12h的基因工程菌种子以5％的接种量转入发酵培养基于30℃、200 rpm条件下培养78h，因FMME-001↑PYC2+↑RoMDH为缺陷型菌株，培养基需添加不同浓 度的Trp、Ade、His。

延胡索酸的测定方法：