[发明专利]一种检测甘蔗宿根矮化病菌的实时荧光定量PCR方法无效
| 申请号： | 201110316557.2 | 申请日： | 2011-10-18 |
| 公开（公告）号： | CN102312016A | 公开（公告）日： | 2012-01-11 |
| 发明（设计）人： | 王恒波;郭晋隆;许莉萍;高三基;陈如凯;陈平华 | 申请（专利权）人： | 福建农林大学 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/01 |
| 代理公司： | 福州元创专利商标代理有限公司 35100 | 代理人： | 蔡学俊 |
| 地址： | 350002 福*** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 检测 甘蔗 宿根 矮化 病菌 实时 荧光 定量 pcr 方法 | ||
1.一种利用实时荧光定量PCR方法检测甘蔗宿根矮化病菌的引物及探针，其特征在于：所述的引物为以下序列的引物对：正向引物序列5’-GGTTCCATTGCTTACCGATT-3’，反向引物序列5’-CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3’，探针序列是FAM-5-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3-TAMRA。
2.一种根据权利要求1所述的引物及探针检测甘蔗宿根矮化病病菌的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）宿根矮化病病菌的Pat1基因片段的克隆及标准曲线绘制：以宿根矮化病致病菌DNA为模板，采用所述引物对进行PCR扩增，切胶纯化，连接到PMD18-T载体上，选择阳性克隆，提取质粒DNA，得到宿根矮化病菌的Pat1基因，测定质粒DNA的吸光值，并将吸光值转化成质粒DNA的浓度，再将质粒DNA的浓度转化成为拷贝数，进行梯度稀释，并以稀释后的质粒DNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线，构建标准曲线方程；
（2）以待测样品蔗汁DNA为模板，用所述引物与探针进行实时荧光定量PCR扩增，通过将产生的的Ct值代入标准曲线方程转化成起始反应的DNA分子拷贝数，即一个分子拷贝数代表一个白条病菌，从而定量检测甘蔗样品中感染宿根矮化病菌的数量。
3.根据权利要求2所述检测甘蔗宿根矮化病病菌的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系为25μL：2×TaqMan Universal Master Mix 12.5μL；10μmol/L正向引物与反向引物各0.75μL；10μmol/L探针0.4μL；DNA模板1.0μL；补水至25μL。
4.根据权利要求2所述检测甘蔗宿根矮化病病菌的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR扩增的反应条件为：50 ℃，2 min，预变性95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，退火延伸，1 min，40个循环，在60℃进行单点荧光检测。
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