[发明专利]利用木薯淀粉为原料生产异丁醇的重组菌株及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别是一种利用木薯淀粉为原料生产异丁醇的重组菌株及其构建方法和应用。 

背景技术

异丁醇(2-甲基丙醇)可用于生产石油添加剂、抗氧剂、油漆溶剂、增塑剂、合成橡胶、合成药物，也是工业上重要的高级溶剂，是生产涂料、清漆的重要配料。 

异丁醇具有易于生物降解，没有生物蓄积作用，不会直接毒害鱼类、两栖动物、甲壳类和藻类的特性。因此，异丁醇作为重要的工业原料，它的生产受到了重视。 

目前工业上大规模生产异丁醇是采用化学合成的方法。异丁醇是在用丙烯羰基合成生产丁/辛醇工艺过程中产生的：丙烯羰基合成反应，粗醛精制得到正丁醛和异丁醛，正丁醛和异丁醛加氢得到产品正丁醇和异丁醇，正丁醛经缩合、加氢得到产品辛醇。异丁醇其实是丁/辛醇生产过程的副产品。 

由于丙烯羰基合成醇的生产能力有限，随着化学品合成市场的转变，国际上主要丁/辛醇生产商，如美国伊斯曼化学、陶氏化学、塞拉尼斯公司等纷纷宣布提价，使异丁醇价格进一步上涨。因此，寻找替代丙烯羰基化学合成方法生产异丁醇成为具有重要前途的工业技术。 

在微生物发酵生产醇类化合物中，乙醇是通过酵母发酵的方法生产，正丁醇是通过梭菌的ABE发酵的方法生产。而异丁醇不同于正丁醇，它的羟基在第二位碳原子上面，在梭菌的ABE发酵中不产生异丁醇。在自然界中也没有微生物天然大量产生异丁醇。 

因此，针对异丁醇生物发酵的问题，只有利用途径工程的方法改造微生物，以获得新型的发酵菌株来生产异丁醇。 

发明内容

本发明目的是提供一种利用木薯淀粉为原料生产异丁醇的重组菌株及其构建方法和应 用，通过改造大肠杆菌的代谢途径，获得直接利用木薯淀粉发酵生产异丁醇的菌株，这个改造的菌株可以用于工业上以木薯为原料生产异丁醇。 

本发明通过以下技术方案达到上述目的： 

一种利用木薯淀粉为原料生产异丁醇的重组菌株Escherichia coli gxas-AIKA，该重组菌株的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2011281。 

一种质粒pSTV29-AIIK，它含有alsS、ilvC、ilvD和kdcA基因，这四个基因分别是来自枯草杆菌的乙酰乳酸合成酶基因、来自大肠杆菌的乙酰羟酸还原异构酶基因和二羟酸脱水酶基因、来自乳脂乳球菌的酮酸脱羧酶基因。 

一种质粒pSE380-AMY，它含有amy基因，这个基因是地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis的淀粉酶基因。 

质粒pSTV29-AIIK和pSE380-AMY共同在大肠杆菌菌株中表达。 

含有质粒pSTV29-AIIK和pSE380-AMY的大肠杆菌菌株gxas-AIKA在以木薯淀粉为唯一碳源的培养基上进行发酵生产异丁醇，具体方法为将gxas-AIKA菌株接种到发酵培养基中，在37℃、250r/min条件下培养，待长至OD₆₀₀为0.4-0.6时加入终浓度1mmol/L的IPTG，并继续培养24小时，得到含有异丁醇的发酵液，异丁醇含量为3克/升。 

本发明突出的实质性特点和显著进步是：提供了一种直接发酵木薯淀粉生产异丁醇的方法。木薯淀粉不需预先加入淀粉酶进行糖化处理，可以直接被本发明所构建的菌株发酵生成异丁醇。 

附图说明

图1是本发明所述重组菌株的发酵液异丁醇气相测定图。 

2.801分钟为异丁醇，2.872分钟为内标正丁醇。 

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案进一步描述。 

实施例1 

本发明所述利用木薯淀粉为原料生产异丁醇的重组菌株的构建方法，包括如下步骤： 

1、质粒pSTV29-AIIK的构建 

1.1基因扩增