[发明专利]通过敲除口蹄疫病毒受体整合素αv亚基基因获得抗口蹄疫转基因牛的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物转基因技术，尤其涉及一种通过敲除口蹄疫病毒受体整合素(Integrin)αv亚基基因获得抗口蹄疫转基因牛的方法，属于细胞工程领域。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth di sease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth di sease virus，FMDV)引起的牛、羊、猪等偶蹄类动物发生的一种急性、热性、高度接触性传染病，世界动物卫生组织将其列为A类烈性传染病之首，一旦暴发，必须扑杀感染及接触感染的动物。2001年英国暴发口蹄疫损失约90亿英镑，占其国内生产总值的1.1％；2005年我国部分地区暴发Asia I型FMD，2009年初多个省区又发生了A型FMD，不仅造成了巨大的直接经济损失，而且严重危害畜牧业的健康发展以及相关产品的对外贸易，对国家的政治、经济具有深远的影响。

目前，大多数流行FMD的国家以计划免疫为主的措施预防FMD。尽管新型疫苗不断涌现，但传统灭活疫苗仍是预防FMD的基础。FMDV变异快，血清型多，且不同血清型疫苗之间没有交叉保护，故通过疫苗免疫的单一手段很难控制和根除FMD。因此，科学家们在注重疫苗研发的同时，开始关注病毒与宿主之间的关系，尤其是病毒受体在病毒感染过程中的作用，期望通过敲除、沉默或封闭病毒的关键受体阻断病毒的感染，进而达到控制和根除FMD的目的。

病毒受体是能够被病毒识别并与之结合，进而导致病毒感染的宿主细胞表面分子，是病毒宿主特异性和组织嗜性的关键因素。FMDV体外感染的受体包括整合素(Integrin)及硫酸乙酰肝素(HSPGs)。一些FMDV弱毒及细胞培养适应毒株可利用HSPGs感染体外培养的细胞(O’Donnell等，2008)，但HSPGs可能只作为一种附属分子增强其它受体的效率，尚无证据表明其在FMDV野毒株感染细胞过程中起作用(Monaghan等，2005)。

整合素是一种跨膜的由α和β亚基以非共价结合形成的胞外基质异二聚体糖蛋白，包括有18种不同的α亚基(α1～α11、αD、αE、αL、αM、αv、αX、αIIb)和8种β亚基(β1～β8)形成24种不同的αβ异二聚体，属于I型穿膜蛋白，每个亚基包括一个大的胞外区、一个跨膜区和一个短的胞浆区。α亚基含有结合二价阳离子的结合位点，β亚基含有4个富含半胱氨酸的重复序列。α和β亚基N-末端形成的球形区域为胞外配体结合域(Arnaout等，2005)，由αv亚基的β螺旋结构域和plexin-semaphorin-integrin(PSI)结构域，以及β亚基的βI-like或βA结构域或混合域组成，每个整合素都有各自的配体结合特异性及组织、细胞分布特异性。RGD结合位点位于β螺旋与βI-like结构域之间的分界面，来自于这两个结构域的氨基酸直接与配体的RGD肽相互作用(Takada等，2007)。一些整合素，如αvβ3、αvβ6、αvβ1、αvβ8、αvβ5、α5β1、α8β1通过结合于RGD基序来识别其配体，尽管有一个RGD，但FMDV似乎也无法使用所有依赖RGD的整合素作为其最初的受体。到目前为止，只有整合素αv亚家族成员αvβ3、αvβ6、αvβ1和αvβ8等4种依赖RGD的整合素可能是FMDV受体(Gutiérrez-Rivas等，2008；Berryman等，2005；Jackson等，2000；Goodwin等，2009；Ruiz-Sáenz等，2009；Johns等，2009)，其中αvβ6被认为是FMDV最主要的受体(Berryman等，2005；Monaghan等，2005；Brown等，2006；O′Donnell等，2009；Ferris等，2005；Burman等，2006；DiCara等，2008；Duque等，2004；Duque等，2003；Jackson等，2000；等，2007)。尽管αvβ1、αvβ3和αvβ8等3种整合素受体的作用尚待进一步研究，但通用亚基αV在病毒感染中起到了至关重要的作用。