[发明专利]三种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属微生物检测领域，涉及一种沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌三重快速检测方法及其检测引物组和检测试剂盒。

背景技术

食品安全是世界各国关注的重大问题，而其中食源性致病菌是影响食品安全的主要原因之一。沙门氏菌(Salmonella spp)是公共卫生领域的重要致病菌，据统计在世界各国发生的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首，我国内陆地区所发生的细菌性食物中毒中也以沙门氏菌为首要原因。除引发食物中毒外，该属的细菌还可以导致胃肠炎、伤寒和副伤寒等疾病。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)隶属于葡萄球菌属，是人类化脓感染中最常见的病原菌，同时，金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种具有耐热(60℃)、耐低温(4℃)、耐盐、耐干燥等性质的食源性致病菌，1986年，WHO和FDA将其列为20世纪90年代食品四大致病菌之一；2000年，被WHO化列为重点监测的食源性致病菌之一。

根据现行国家食品安全监管体系，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌均属重点关注的食源性致病菌。常规检测采用传统培养方法，且每个致病菌需应用独立的检测方法单独进行检测，工作量大，检测周期长，且受到检测人员专业、经验等多种因素限制，容易出现误判。随着分子生物学方法在食品微生物检测中的逐步应用，致病菌的检测效率也逐步提升。但目前所采用的普通PCR方法和荧光PCR方法虽可提高检测效率，但对仪器设备要求较高，对检测人员的专业背景和检测能力也有一定要求，因此无法大范围的推广使用。

LAMP方法是一种新型的恒温核酸扩增技术，该技术主要利用4种不同的特异性引物识别靶DNA上6个特定区域，并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(BstDNA)，在恒温条件下快速扩增核酸，保证了扩增的高特异性和高效率。由于LAMP独特的核酸扩增机制，它的产物是由多重复靶序列的茎一环状DNA和花椰菜状DNA所组成的混合物，在琼脂糖凝胶电泳上会呈现出LAMP反应典型的阶梯状条带；同时，核酸大量生成时，从dNTPs中析出的焦磷酸根离子与反应体系中的Mg²⁺结合，产生肉眼可见的扩增反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀；另外，由于扩增产物大量生成，加入荧光染料(如Syber Green I、溴化乙锭、Gel Red等)后，可在紫外灯下观察到明显荧光。因此LAMP扩增结果不但观察方式多样，且结果鉴定简便，非常适合高通量的快速检测。

鉴于LAMP技术有众多优势，现已被逐渐应用于病原微生物的检测。如分支杆菌属、阪崎肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。但目前已有的方法只能在一个系统中针对某一种致病菌进行检测，在需要快速筛查多个致病菌时，需分别对其进行检测，仍有较大工作量。多重恒温核酸检测技术能在同一反应体系中，同一反应条件下，实现多个目的菌的快速筛查，具有广阔的应用前景。经国内外文献查询，尚未见有LAMP应用于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌多重快速检测的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种三种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒，从而克服目前已有的方法只能在一个系统中针对某一种致病菌进行检测、而不能同时对同一系统中是否同时存在多种致病菌进行判断的缺陷。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明沙门氏菌的快速检测引物组的外引物的上游引物具有如SEQ No.1所示的序列，其外引物的下游引物具有如SEQ No.2所示的序列；其内引物的上游引物具有如SEQ No.3所示的序列，其内引物的下游引物具有如SEQ No.4所示的序列。

本发明金黄色葡萄球菌的快速检测引物组的外引物的上游引物具有如SEQ No.5所示的序列，其外引物的下游引物具有如SEQ No.6所示的序列；其内引物的上游引物具有如SEQNo.7所示的序列，其内引物的下游引物具有如SEQ No.8所示的序列。

本发明单增李斯特菌的快速检测引物组的外引物的上游引物具有如SEQ No.9所示的序列，其外引物的下游引物具有如SEQ No.10所示的序列；其内引物的上游引物具有如SEQNo.11所示的序列，其内引物的下游引物具有如SEQ No.12所示的序列。