[发明专利]一种饲料中木聚糖酶活力的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种测定饲料中木聚糖酶活力的方法，具体涉及饲料中酶的提取方法，具体的测定手段及测定关键参数的选择。

背景技术

木聚糖酶可提高动物对饲料的利用率，因而已广泛应用于饲料工业。酶活力是衡量酶生物活力的重要指标。木聚糖酶属多糖水解酶，目前企业一般采用DNS法来测定该酶的活力，国家也颁布了《GB-T 23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法》，该法由于其灵敏度较低已很难满足当前具有微量酶含量的配合饲料的酶活力测定，只适用于单一的饲料添加剂木聚糖酶活力测定。虽然此法简便、快捷，但灵敏度相对较低，不适于饲料中酶的定量分析，因而不利于相关科学研究和产品质量控制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测饲料中木聚糖酶活力的方法，该方法可以将饲料中的木聚糖酶完全浸提出来，同时成功地解决了背景干扰的问题，具有检测周期短、比DNS法具有更高灵敏度的优点。

为了实现本发明的目的，发明人针对已有技术的不足，通过大量的试验摸索，最终获得了如下技术方案：

一种饲料中木聚糖酶活力的测定方法，包括如下步骤：

(1)绘制木糖吸光度值与木糖浓度的标准对应关系曲线：分别取6-15组不同浓度的木糖标准溶液与具有相同木聚糖浓度的木聚糖溶液等体积混合而得浓度0-0.03mg/mL(试管法)或0-0.08mg/mL(微孔板法)的木糖溶液，其中0-0.03mg/mL的木糖溶液用于试管法测定体系，0-0.08mg/mL的木糖溶液用于微孔板法测定体系，然后根据测得的木糖吸光度值与木糖浓度之间的关系绘制标准对应关系曲线；对于木聚糖和饲料本身还原性物质含量较高的情况，在测定时使用较短光程的比色皿进行测定，或者用水将不同浓度的所有木糖的显色产物进行按比例稀释到1-3倍，从而得到相应的木糖吸光度值与木糖浓度之间的对应关系曲线，以此作为酶活力测定的计算依据；

(2)饲料中木聚糖酶浸提液的制备：以下操作均要求在0-10℃进行，粉碎含木聚糖酶的饲料使其全部通过40-80目筛，充分混合，从中精密称取1.0000-2.0000g饲料样品于锥形瓶中，加入50ml缓冲液，于60-150rpm的摇床中振摇或用混合器间歇混匀30-60分钟，取出在8000rpm离心15分钟得上清液即为样品的木聚糖酶浸提液，将浸提液按比例稀释至一定浓度即可用于酶活力测定，对于饲料本身还原性物质较高的情况，将浸提液透析或超滤截留分子量在1万道尔顿以上后再稀释至一定浓度用于测定；

(3)酶解反应：将预热至所设定酶解温度25-40℃的木聚糖溶液与预热至同一温度的木聚糖酶浸提液等体积充分混匀，起始酶解反应，准确计时，酶解时间为30-60分钟，取水解液迅速加入到等体积的0.5N NaOH溶液中，充分混匀至终止反应，进行还原糖浓度的测定，此酶活力测定过程在试管法测定体系或微孔板法测定体系中完成，试管法的用量是微孔板法的10-20倍；

(4)根据从步骤(1)中所得到的标准曲线计算木聚糖酶的酶活力，木聚糖酶的活力单位被定义为在上述条件下，每毫升反应液中，每分钟产生1nmol相当于木糖所需的酶量为一个酶活力单位，计算公式如下：

U/g=50×cm×t×N;]]>

其中：U-样品木聚糖酶的活力，U/g；

C-样品溶液实测吸光度值在标准曲线中对应的还原糖浓度，nmol/mL；

50-用于溶解饲料的缓冲液的体积，mL

N-样品溶液在酶解体系中的总稀释倍数；

m-样品质量，g；

t-反应时间，min。

优化的，所使用的木聚糖为桦木、榉木、燕麦、小麦或玉米中的木聚糖。

优化的，所述的水为蒸馏水或去离子水。