[发明专利]结核菌检测用的引物和探针以及使用它们检测人型结核菌的方法

说明书

本申请是中国专利申请200580013120.4(其分案申请的申请号201010295270.1)的分案申请，原申请的申请日是2005年4月22日，发明名称是“结核菌检测用的引物和探针以及使用它们检测人型结核菌的方法”。

技术领域

本发明涉及利用核酸扩增及其检测体系，在临床检查中检测人型结核菌：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，以下称为人型结核菌)的检测方法。

背景技术

人型结核菌是导致人产生结核病的病原体，是被分类在分枝杆菌属(Mycobacterium)并具有抗酸性质的革兰氏阳性杆菌。结核病虽然近年显著减少，但是，最近产生了老年人的发病率上升、在没有经历过结核感染的年轻人中引起集体感染等重大问题。

另一方面，除了人型结核菌以外，已知鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)等非结核性抗酸菌对人表现病原性。另外，在感染AIDS病毒的免疫缺陷者当中，非结核性抗酸菌引起疾病成了主要问题。由于这些非结核性抗酸菌病多数对抗结核药具有抗药性，所以在决定治疗方案时，鉴别诊断结核病和非结核性抗酸菌病是很重要的。但是，从临床症状、病理组织学的观点来看，鉴别结核病是非常困难的，因此诊断必须通过菌的鉴定来进行。

在鉴别诊断结核病或非结核性抗酸菌病时，一般通过小川培养基分离培养样品，为了鉴定种而进一步采用进行生化试验的方法。然而，通常由于分枝杆菌属生长慢，培养时需要相当长的时间。因此，进行历来的基本方法的涂片试验或培养试验时，为了得到结核病与否的诊断结果，光是菌的分离培养就需要3～4周时间，然后在鉴定种的各种试验中还需要2～3周时间。

另外也有使用针对分枝杆菌属的抗原的抗体的结核菌检测法，但是，由于分枝杆菌属种之间的交叉反应，欠缺相对于结核菌的特异性，灵敏度也不够。

近年，利用聚合酶链反应(PCR)等的核酸扩增技术的诊断技术作为有用的方法被研究，也研究了可以被利用到结核菌的诊断中，研究了结核菌DNA基因组的各区域是否在用PCR进行的结核菌检测中可以用作靶标。

例如报道了检测编码分枝杆菌属的65千道尔顿抗原的基因区域的方法(例如参照非专利文献1、非专利文献2、非专利文献3、非专利文献4、非专利文献5)。然而，已知65千道尔顿抗原基因除了在人型结核菌中具有以外，在鸟分枝杆菌(M.avium)(鸟型结核菌)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、BCG和海分枝杆菌(M.marinum)等同属菌中也具有。尤其是，由于与非结核性抗酸菌病的典型的病原菌鸟分枝杆菌或堪萨斯分枝杆菌的交叉性高，因此检测65千道尔顿抗原基因的方法作为特异地检测人型结核菌的方法还存在问题。

另外，研究了使用自牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)DNA鉴定的序列-编码MPB70蛋白质的基因序列进行结核分枝杆菌的鉴定的试验方法(例如，参照非专利文献6)。然而，Kulski等人在FEMS Microbiol Lett.1997年3月1日；148(1)：43-48(非专利文献7)报道了其结果，已知其中进行的PCR检验结果在以MPB70蛋白质作为靶标时，与堪萨斯分枝杆菌的DNA中存在的类似序列产生交叉反应，该方法在特异地检测人型结核菌检测中也存在问题。

此外，报道了编码蛋白质抗原b(Pab)的基因序列作为标记的结核分枝杆菌/牛分枝杆菌的检测方法(例如参照非专利文献8)，证实了以结核分枝杆菌/牛分枝杆菌检测目的使用该标记的有效性。但是，由于考虑到Pab基因在结核基因组中仅存在一个拷贝，因此不太优选作为核酸扩增的靶标材料(相对地，后述的IS6110序列在核酸基因组中存在10个拷贝。)。