[发明专利]一种监测DNA合成期生物发光报告基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及细胞分子生物学领域，主要涉及一种监测 DNA 合成期的生物发光报告基因，本发明还涉及该基因在抗肿瘤药物筛选中的应用。

背景技术

细胞从一次分裂结束开始，经过物质积累，直到下一次细胞分裂结束为止，称为一个细胞周期。一个细胞周期可以人为地分为4个时期，即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和有丝分裂期（M期）。正常细胞周期的运转由多种机制控制，以确保细胞分裂的有序进行，而当细胞周期调节失控时会导致肿瘤的发生。肿瘤细胞与一般正常细胞的最大差别是在于它能够一直无限的增殖，这是肿瘤细胞的细胞周期已不受正常调控最明显的证据。如果能够利用药物去抑制肿瘤细胞的细胞周期，使肿瘤细胞停止生长，甚至诱导肿瘤细胞发生程序性死亡，那么就能够达到杀死肿瘤细胞治疗恶性肿瘤的目的。S 期是细胞进行大量 DNA 复制的阶段，组蛋白和非组蛋白也在此期大量合成，最后完成染色体的复制。DNA 复制需要多种酶的参与，包括 DNA 聚合酶、DNA 连接酶、胸腺嘧啶核苷酸激酶、核苷酸还原酶等。由于 S 期是细胞周期的关键时刻，因此目前许多抗肿瘤药物都是针对影响肿瘤细胞的S期所研发的。

在抗癌药物的研发过程中，传统的动物实验方法需要肿瘤生长到一定程度后处死动物切除肿瘤，然后通过免疫组化等技术才能获得检测指标。这种具有侵袭性的研究方法，需要处死大量的动物，不能在同一组动物身上重复试验，很难直观、活体、动态地连续观察肿瘤的生长转移情况，特别是无法研究药物作用下影响细胞的增殖动态变化以及细胞死亡的动力学变化等重要的时空信息。因此，建立一种可以在活体小动物实时、反复、非侵袭性地研究抗肿瘤药物模型不仅可以加速药物的研发，快速优化新的治疗方案，降低在研发药物上所用动物的数量，而且还可以对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估，对于抗肿瘤药物的筛选及其作用机制研究具有重要意义。

分子光学成像技术作为一种非侵入性动态成像技术，以其高分辨率、高灵敏度正越来越多的应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面，成为近年来动物模型研究最重要的进展，这一技术的完善和发展使非侵袭性研究抗肿瘤药物的分子机制成为可能。该技术可以利用活体生物发光或荧光成像实时及连续动态监测活细胞在动物体内的各种生物学过程，因而能够在不处死实验动物的前提下，实时监测体内疾病变化的整个过程，可以对同一动物体进行连续观察，减少动物个体间差异的影响，还可以减少实验动物的数量。鉴于上述情况，本发明拟利用荧光素酶基因标记细胞周期蛋白 A2（cyclinA2）, 从而构建一种具备高度敏感性，可以实时、反复地测定S期变化的光学影像报告系统，用于探讨研究筛选 S 期敏感的抗肿瘤药物。

cyclinA2 由 432 个氨基酸组成，其中 210~295 位氨基酸为 “ cyclin box ” ，在 N 末端 47~55 位氨基酸序列称为 “destruction box（D-Box）”，D-Box 决定泛素连接酶 APC^cdc20 是否特异性地与 cyclinA2 结合，是泛素化介导的蛋白降解的重要信号。cyclinA2 与 CDK2 结合，在 G l~S 转变过程中被活化，从而调控 S 期进展。在整个细胞周期中，cyclinA2 的变化是受转录、翻译及翻译后修饰来调节的。在 G1 晚期开始逐渐增加，S 期积累到峰值，早中期后通过依赖 APC/C 泛素化途径降解，CDC20 分子在此降解过程中发挥重要作用。因此 cyclinA2 可以视为一种细胞周期 S期的特异性蛋白，反映 cyclinA2 蛋白的转录与翻译后调控的报告基因可以报告细胞周期的 S 期。基于以上 cyclinA2 的调控机制，本发明通过基因工程技术将 cyclinA2 基因全长与荧光素酶基因融合作为S期的报告基因，在离体培养的细胞株中验证了其作为筛选 S 期特异性抗肿瘤药物的分子影像报告系统的可行性，并为在体筛选 S 期抗肿瘤药物及研究 S期的调控机制奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一个实时、非侵袭性地监测 DNA合成期（S期）的生物发光报告基因。

本发明的另一目的是提供该基因在以 S 期为靶点的抗肿瘤药物筛选领域中的应用。

本发明的目的是这样实现的：

一种监测 DNA 合成期生物发光报告基因，其特征在于：将细胞周期蛋白 A2 与荧光素酶基因融合，从而形成一种可以用于监测细胞周期 S 期的生物发光报告基因，其核苷酸序列为：