[发明专利]从膨胀液中分离脂肪间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及从膨胀液中分离脂肪间充质干细胞的方法，属于生物医药领域。

背景技术

间充质干细胞【mesenchymal stem cells,MSC】是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

目前，脂肪干细胞的分离主要是从抽取的脂肪组织来源，已有的专利申请目前都是从脂肪组织中提取，例如：一种脂肪干细胞的分离培养方法(申请号：CN201010568873.4，公开号：CN102002478A)；人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法(申请号：CN201010120944.4，公开号：CN102002475A)；一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法及其应用(申请号：CN200410084407.3，公开号：CN1778905)；从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法(申请号：CN201010580537.1，公开号：CN101984049A)。还尚未有人报道从膨胀液中分离脂肪干细胞的专利。

膨胀吸脂是目前在外科吸脂手术中应用的最为广泛一种技术，主要是在手术前灌注超量低渗膨胀液，该液具有止痛、止血、疏松及裂解脂肪细胞的作用。本发明人从临床应用中发现，抽脂过程中获得的膨胀液也含有一定量的脂肪干细胞。这为干细胞的获取提供了新的来源，增添了新的脂肪干细胞来源途径。

发明内容

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种从膨胀液中分离脂肪间充质干细胞的方法，由以下步骤组成： （1）膨胀液的收集     抽脂前向所要抽取部位灌注过量低渗膨胀液，然后将抽脂过程中获取的脂肪与膨胀液混合液约500ml置于室温下放置10min，待脂肪与膨胀液完全分离后，用移液枪吸取黄色脂肪下面部分的红色液体，即为含有脂肪干细胞的膨胀液。，将其分装入50ml离心管。 （2）膨胀液的处理      将收集到的膨胀液放入离心机以1500rpm离心5min。离心吸取弃掉离心管上面部分的液体，收集沉淀。每管用PBS液悬浮，加入红细胞裂解液室温静置5分钟，以1200rpm离心3min，弃上清液。 （3）细胞的洗涤     加入5ml DMEM（不含血清）将沉淀吹散，细胞滤器过滤。过滤以后的液体以1200rpm离心3min，沉淀即为要获取的脂肪间充质干细胞。再加入DMEM（不含血清）重复以上的操作洗涤3次。

（4）细胞培养

将获取细胞接种至75cm²细胞培养瓶内，接种，加入间充质干细胞培养基。37℃，5%CO₂培养。

（5）细胞鉴定

对分离培养的细胞与脂肪来源干细胞进行形态学、免疫表型鉴定并进行比较。

（6）对膨胀液来源脂肪干细胞进行成脂、成骨和成软骨三向分化潜能鉴定。

 

进一步的，步骤1中所述的膨胀液是在1000ml生理盐水中加入20ml利多卡因和1ml肾上腺素制备得到的。

进一步的，步骤2所述PBS液的加入量为3 ml，红细胞裂解液加入的体积量为沉淀和PBS液总体积的1-2倍。

进一步的，步骤4中接种密度为5000个/cm²，间充质干细胞培养基的加入量为10 ml。

进一步的，步骤5中的免疫表型鉴定是指对CD73, CD90, CD105和CD45,CD34, CD14, CD11b, CD19 , HLA-DR进行检测。

进一步的，步骤6中的分化潜能鉴定是对分离细胞进行成脂、成骨和成软骨三向分化潜能测试。

本发明上述方案中采用的材料和试剂如下：

膨胀液：利多卡因 20ML/L  肾上腺素 1ML/L；

红细胞裂解液 Solarbio，北京；

DMEM（不含血清） HyClone，美国；

间充质干细胞培养基 stemcell 美国；

抗体 BD，美国；

离心管 Coring，美国；

移液管 Coring，美国；

细胞滤网 BD，美国；

移液枪 BRAND，德国；

离心机 湘麓，湖南；

培养瓶 Coring，美国；