[发明专利]一种用于化工废水处理的生物活性预警标记方法

权利要求书

1.一种用于化工废水处理的生物活性预警标记方法，其特征在于该方法包括：

（1）提取污水处理系统各反应池中的活性污泥中微生物基因组总DNA，同时通过富集培养的方法筛选菌种并对其进行鉴定；

（2）筛选PCR-DGGE引物：分别为V3区、V6-V8区、V9区通用引物，及优化变性剂范围和电泳时间；

（3）用细菌16S rDNA的V6-V8区通用引物扩增微生物基因组总DNA的V6-V8区；

（4）对PCR产物进行PCR-DGGE分析，并对图谱中的条带进行测序分析；

（5）通过PCA载量分析找到载量较大的DGGE条带，这些条带代表的微生物是系统运行中的功能性微生物，并对其进行鉴定；同时结合步骤（1）中筛选到的菌株，找到系统中与COD变化密切相关的菌株，该菌株能够用于判断系统运行情况；

（6）使用RAPD技术得到菌株纯培养菌株的特异分子标记基因，通过功能菌特异分子标记基因的PCR，能够直接判断功能菌的存在情况，对污水处理系统进行监控。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）所述的基因组总DNA的提取方法是：

①样品预处理：分别量取各反应池中的30mL活性污泥样品，10000rpm，4℃离心5min，弃上清液；沉淀中加入100mL的TENP buffer，TENP buffer的组成为50mM Tris、20mM EDTA、100mM NaCl、1%PVP及pH=10，加4粒灭菌的玻璃珠，旋涡振荡2min，同上离心操作，弃上清液；加入100mL的生理盐水，洗涤两次；

②细胞裂解：将预处理后的污泥样品分别称取0.2g装入1.5mL的EP管，加入600uL的Extraction Buffer，Extraction Buffer的组成为100mM Tris、100 mM EDTA、200 mM NaCl、2%CTAB及pH8.0，旋涡振荡5min，再加入600uL的SDS Buffer，SDS Buffer的组成为100mM的Tris、200mM的NaCl、2%SDS及pH8.0，上下颠倒5min；

③反复冻融：将EP管放入-80℃冰箱15min，50℃水浴2min，重复3次；

④去蛋白：加入等体积的酚：氯仿：异戊醇=25：24：1的溶液抽提蛋白至无蛋白层出现为止，吸取上清液加入新的EP管，加入等体积的氯仿：异戊醇=24：1的溶液除去残留的酚，15000rpm，3min，吸取上清液；

⑤DNA分离纯化：加入等体积的异丙醇沉淀DNA，15000rpm，6min，弃上清，沉淀中加入500mL的70%乙醇洗涤干燥，将沉淀溶于40uL的TE buffer，TE buffer的组成为pH=8.0，10mM pH8.0的Tris-Cl，1mM pH8.0的EDTA，-20℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）所述的PCR程序为：

PCR反应为50 μL体系，组成为：含2.5 mM Mg²⁺的10×PCR buffer 5 μL；2.5 mM 的dNTPs 5 μL；20 mM的上游引物V6-8F-GC 1 μL；20 mM的下游引物V6-8R 1 μL；模板DNA 1～10 ng；Taq酶0.5 μL；最后加超纯水至50 μL；

PCR程序为Touchdown PCR：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，65℃复性1 min，72℃延伸1 min，之后每两个循环降低1℃，共20个循环；94℃变性1 min，55℃复性1 min，72℃延伸1 min，共15个循环；最后72℃延伸10 min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）所述具体操作为：

胶浓度为6%，组成为丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=37.5:1；变性梯度范围为30%～70%，变性剂的配制方法为100%的变性剂中含有7 mol/L的尿素和40%的去离子甲酰胺；在组成为20 mM Tris，10 mM冰乙酸，0.5 mM EDTA，pH7.4的1×TAE缓冲液中，60℃，160V运行4 h；电泳结束后，用1mg/L的EB溶液对凝胶染色15min，脱色3min；用凝胶成像系统对凝胶进行分析，所得图像用Bio-Rad Quantity One软件进行分析处理。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（5）所述具体操作为：

使用SPSS软件，通过其PCA载量分析找到载量较大的DGGE条带，并对其测序进行分子生物学鉴定；找出DGGE图谱中条带亮度变化与COD降解效率变化相关的条带，从这些条带中得到的DNA序列就能够用来跟踪和检测与系统COD去除效率相关的微生物菌种；通过对污水处理系统中的菌种进行分离纯化鉴定得到纯菌株，将其与微生物基因组总DNA进行PCR-DGGE分析。