[发明专利]蚕蛹中人生长激素类似脂蛋白的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于一种蚕蛹中人生长激素类似脂蛋白的纯化方法。

背景技术

蚕蛹是人类的一种新营养源，是卫生部批准的作为普通食品管理的食品新资源名单中唯一的昆虫类食品。蚕蛹具有极高的营养价值，含有丰富的蛋白质、脂肪酸、维生素。食用蚕蛹对胆固醇酯化，降低血中胆固醇和甘油三酯；降低血液粘稠度，改善血液微循环有一定的功效。但目前，市场上基本还未出现以蚕蛹中有效成分作为药物开发的产品，缺乏这些天然成分的的纯化方法。

发明内容

本发明的目的是设计一种蚕蛹中人生长激素类似脂蛋白的纯化方法，能利用蚕蛹作为原料，通过分离纯化获得具有降低血液粘稠度，改善血液微循环的天然药用蛋白，该方法操作简便，且产量高，适用于大规模生产，提纯的天然蛋白可作为保健药物，无毒副作用。

为此，本发明的包括下步骤：

(1)蚕蛹预处理，将新鲜蚕蛹与预冷的PBS液，温度1～5℃，pH值为7.4，按重量比1∶1加入到榨汁机中匀浆30sec，在冰上冰浴4～8min，继续匀浆，重复三次，使蚕蛹中的蛋白充分溶解，

将所得品转移到离心杯中4℃，12000rpm离心20min，取上清液通过九层纱布过滤除去大颗粒不溶杂质，将滤液再次离心过滤，重复三次，

收集过滤后的滤液4℃，60％硫酸铵沉淀蛋白，去除油脂，8000rpm离心30min，弃上清，用预冷的PBS液重悬沉淀，0.45μm滤膜真空抽滤，得预处理上清液，4℃保存；

(2)人生长激素类似脂蛋白的初步分离，选择AKTA explorer10中的Size Exclusion对预处理上清液进行分离并脱去色素，流动相为PBS液，pH值为7.4，压力0.5Mpa，流速1.5ml/min；程序结束后，共出现6个蛋白吸收峰，根据目的出峰时间判断第5和第6号蛋白吸收峰为17kDa以下的色素及小分子物质，人生长激素类似脂蛋白，分子量30kDa，应出现在第4号峰，因此收集前面4个蛋白吸收峰，并进行SDS-PAGE电泳和Western Blot检测，结果表明人生长激素类似脂蛋白存与第4号蛋白峰中，用4号蛋白吸收峰的所得品进行后续纯化；

(3)亲和层析纯化，用4号蛋白吸收峰的所得品进行亲和层析纯化，

亲和层析柱的制备取2mL 50％的Plus coupling Resin装入柱壳中，平衡至室温，放出残余液体，加入3倍柱体积Coupling Buffer，0.1M Sodium phosphate，0.15M NaCl，pH值为7.2，平衡柱子，之后加入2mL hGH标准品1mg/ml和40μL Cyanoborohy dride，室温下摇床孵育4h或4℃保持7～9h，在通风橱里打开盖子，收集放出的液体，用BCA蛋白定量，计算偶联效率；再加入5倍柱体积Quenching Buffer，1M Tris-HCl，pH值为7.4，0.05％NaN₃，洗填料，之后加入2mL Quenching Buffer和40μL Cyanoborohy dride，室温下摇床孵育30min；在通风橱打开盖子放出反应的气体和溶液，加入5倍体积Wash Solution，1M NaCl，0.05％NaN₃洗柱子；再用Coupling Buffer平衡柱子，4℃保存；

亲和纯化人生长激素类似脂蛋白，室温平衡柱子，之后打开盖子弃去保护液，用5倍柱体积的Binding Buffer，0.15M PBS，pH值为7.4，再次平衡柱子；所得品经过0.45μm滤膜过滤后上柱，室温摇床孵育1h，放出溶液，用Wash Buffer，0.15M PBS，pH7.4，洗去未结合样品，最后加入Elution Buffer(0.1M Glycine-HCl，pH值为2.5，洗脱结合在柱子上的蛋白，用Neutralization Buffer，0.5M Tris-HCl，pH值为8.5，调pH值至中性；收集样品，BCA蛋白定量后进行SDS-PAGE电泳检测；

(4)超滤浓缩，使用中空纤维膜进行超滤，选择合适的中空纤维膜规格，截留分子量为3kDa，进行清洗后加样，用适量无菌PBS，pH值为7.4，超滤浓缩，无菌分装，-50℃冷冻干燥，制成冻干粉，得本发明的成品。

所述的亲和层析纯化是用4号蛋白吸收峰的所得品进行亲和层析纯化。

上述方法实现了本发明的目的。