[发明专利]应用乳腺上皮细胞制备乳腺特异性表达转基因动物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物乳腺上皮细胞转基因技术；转基因乳腺上皮细胞诱导表达技术及转基因乳腺上皮细胞核移植技术。

背景技术

体外转染外源基因的细胞作为供核细胞进行细胞核移植可以获得绝大部分整合外源基因的动物，此方法与传统的显微注射相比效率得到了明显提高。但是，由于外源基因整合位置效应，在这些转基因后代中仅有一部分具有表达外源基因的功能，因而其效率仍然较低。如果能在细胞核移植之前获得具有表达潜能的细胞系，将进一步提高转基因动物的效率。乳腺上皮细胞具有合成和分泌乳汁的功能，是乳腺生物反应器的靶细胞，可以用体外培养的乳腺上皮细胞作为转基因载体，可以预测将要获得的转基因动物的表达特性，这可以减少实验动物的数量，缩短研发时间，提高效率。本发明应用乳腺上皮细胞诱导表达技术和体细胞克隆技术，制备高效乳腺特异性表达转基因动物，从而获得表达外源基因的转基因动物，达到转基因的最终目标。

动物转基因技术在农业、医学和基础研究中有广泛的应用，乳腺上皮细胞能合成并分泌目的蛋白到培养液中，通过检测诱导表达目的蛋白产物来筛选高效表达的细胞，该方法成本低、可靠性高。本专利可应用于转基因乳腺生物反应器制备、转基因家畜育种及转基因动物模型的制备及乳腺特异表达载体的效能评估。

发明内容

外源基因在动物乳腺特异性表达可用于制备转基因动物乳腺生物反应器，也可用于奶牛、奶山羊等乳品改良及转基因动物新品种培育。在乳腺特性表达转基因动物制备中，获得高效表达动物是其最终目的，但通过现有技术制备乳腺特异性表达转基因动物的效率较低，虽然通过体细胞克隆技术可以得到随机整合动物，但这些整合个体中仅有少部分具有外源基因表达功能。如果在制备转基因动物的前期（细胞培养阶段）就能对选择的细胞系是否具有潜在的个体表达功能，将大大提高转基因动物制备效率。本发明提供了一种高效制备乳腺特异性表达转基因动物的技术。

本发明的技术方案为：动物乳腺上皮细胞转基因→转基因乳腺上皮细胞诱导表达→具有表达功能的乳腺上皮细胞核移植→获得乳腺特性表达转基因动物。

一种应用乳腺上皮细胞制备乳腺特异性表达转基因动物的方法，包括以下步骤：

（1）外源基因通过表达载体转染体外培养的乳腺上皮细胞，并应用催乳素3-8μM诱导表达； （2）筛选获得高效表达乳腺上皮细胞系； （3）高效表达细胞系进行一步或二步细胞核移植，获得乳腺特异性表达个体。

本发明进一步优选的技术方案推荐步骤（2）具体为：取每株细胞中的1/2-1/3细胞传代培养至50-80%丰度时在培养液中添加催乳素(3-8μM)诱导外源基因的表达,在24-96小时取上清液进行外源基因表达检测（ELISA或其它生物检测手段）。

本发明优选的技术方案还有在步骤（3）具体为：用筛选到高表达细胞系作为供核细胞进行细胞核移植. 其中部分20-50天的克隆胎儿进行二次核移植，提高获得表达个体频率。

   本发明可提高转基因动物制备效率，节省材料60%-80%，缩短转基因动物研究开发时间。本发明可用于基因构件表达性能评估、转基因动物乳腺生物反应器研制、生物制药、动物转基因生物新品种培育等。

附图说明

图1 是表达载体基本结构。

图2是乳腺特异性表达转基因动物的制备方法示意图。

图3是用于转染乳腺上皮细胞的pBnCL14线性DNA结构图。

具体实施方式

实验材料

培养液DMEM/F12；胎牛血清FCS；电转染液（Hypoosmolar Buffer）从eppendorf公司购；FSH，LHRH和PG从宁波激素厂购；其他涉及的化学试剂均可从Sigma公司或国内其它生物工程公司购得.实验用山羊。

．人溶菌酶转基因乳腺上皮细胞制备

2.1  乳腺上皮细胞分离和培养：