[发明专利]一种清除伪狂犬疫苗种毒中的支原体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种清除伪狂犬疫苗种毒中的支原体的方法，属于生物制品 领域。

背景技术

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)属于疱疹病毒科，α-疱疹病毒 亚科，是一种单股双链DNA病毒，有囊膜，可引起多种家畜和野生动物出 现以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要病症的急性传染病-伪狂犬病。猪是伪狂 犬病毒原发感染宿主，感染后可引起仔猪大批发病、死亡，引起母猪繁殖功 能障碍-流产或产木乃伊胎、死胎、弱胎。

伪狂犬病在世界范围内分布广泛，对猪业健康发展的危害程度仅次于口 蹄疫、猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征。疫苗接种是有效防制伪狂犬疫病的重要 手段，故伪狂犬疫苗接种也是我国各型猪场基本免疫程序的重要一环，我国 巨大的生猪存栏量决定了伪狂犬疫苗市场容量之巨，现我国市面上已有数十 家疫苗生产企业生产的伪狂犬疫苗，但是由于支原体对疫苗的污染，导致生 产成本较高，且疫苗的安全性难以控制。

支原体(Mycoplasma)：又称霉形体，是介于细菌及病毒之间的一种原 核生物，无细胞壁和固定形态，大小介于0.2-0.3μm之间，大部分可通过普 通0.22μm细菌滤器。支原体污染会干扰细胞正常新陈代谢，影响DNA和 RNA的合成，从而引起病毒产量下降，影响产品品质；同时支原体注入动物 机体内会造成动物免疫抑制甚至发病，我国颁布的《中华人民共和国兽药典》 明文规定疫苗制品内不能含有支原体。

伪狂犬疫苗生产的核心是伪狂犬种毒的制备，其在复苏、增殖及建立种 子库的过程中面临受支原体污染的风险较大，而种毒是疫苗生产最初始的上 游源头，一旦种毒发生支原体污染，将造成极其严重的后果。因此，除去疫 苗种毒中的支原体是至关重要的，也是伪狂犬疫苗生产企业及科研人员极力 解决的关键问题之一。

除了通过合理清洁消毒、严格按规范操作降低支原体污染发生风险之外， 目前已经报道的清除种毒支原体污染常见方法有很多种，如，过滤法、抗生 素处理法、高温处理法、接种动物法和接种动物法。但是，现有的方法均不 能在保证伪狂犬病毒存活的情况下，彻底除掉支原体：1.过滤法：已有孔径 小于0.22μm的滤器可以滤去大多数病毒中的支原体，但是由于伪狂犬病毒 粒子大小为0.18μm左右，其与支原体大小很接近，目前通过过滤无法将二 者有效分开；2.抗生素处理法：支原体对某些抑制蛋白合成的抗生素敏感， 如氯霉素、庆大霉素、喹诺酮类及环丙沙星类，据报道这些药物能良好抑制 或杀灭支原体，同时不影响病毒活性，但是这些抗生素对细胞有潜在毒性， 同时其以抑制为主要的作用机理让人对其彻底杀灭支原体的效果担忧，该方 法存在杀灭不彻底，停药后可能反复的风险，即使彻底杀灭整个用药周期至 少需要14-21天的时间，另外，抗生素使用带来的耐药性问题是其另外一个 难以预料的副作用；3.高温处理法：加温至40-50℃维持一段时间，利用高 温破坏支原体活性进而杀灭支原体，但是同处于一个体系中的病毒粒子的活 性也会受到影响甚至失活，4.接种动物法：此法是将受支原体污染的病毒液 接种于实验动物如小鼠皮下或腹腔，利用动物的免疫系统杀灭支原体，但是 此法对动物卫生等级要求甚高，否则会有引入外源微生物的风险，至少需要 SPF级，因而操作复杂、成本高、饲养管理难度大，很难保证杀灭彻底，周 期较长。另一方面，伪狂犬疫苗种毒对猪是安全的，对小鼠或兔却具有致病 性，即实验动物机体在彻底清除支原体前就会因伪狂犬发病死亡，难以达到 去除支原体的目的；5.溶剂抽提法：印彤等，“采用溶剂抽提法可完全去除 病毒制品中的支原体”，1996年第19卷第1期报道了利用乙醚和氯仿对污染 支原体的5型腺病毒和RNA α病毒进行抽提可在保持病毒效价的前提下，完 全除去其中支原体，但是伪狂犬病毒对乙醚和氯仿高度敏感，极易失活，发 明人曾多次根据该文献报道的方法除去伪狂犬种毒中的支原体，结果发现该 方法杀死支原体后，伪狂犬种毒本身也失活即病毒经此处理后死亡，无法重 新增殖出病毒，不能再用于制备伪狂犬疫苗，不具有实际应用的价值。

综上，人们一直以来寻找许多方法来去除伪狂犬病毒中的支原体，但是 都未能达到理想的效果，要么难以彻底除去支原体，要么在彻底除去支原体 的同时也会杀灭伪狂犬病毒。为了保证伪狂犬疫苗的品质，亟需寻找一种彻 底除掉支原体，且能保证伪狂犬病毒活性的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的去除伪狂犬疫苗种毒中的支 原体的方法。