[发明专利]一种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及生物兽药技术领域，涉及一种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗。

背景技术

鸡球虫病是一种严重危害养鸡业生产发展的寄生原虫病，每年因此而导致的经济损失高达20亿英镑以上。随着鸡球虫抗药性和药物残留问题的日趋严重，人们期待用更理想的方法代替抗球虫药的使用。然而球虫活疫苗的成功研制和应用提供了一种可代替药物控制鸡球虫病的技术手段，但却存在成本高、难保存、散毒及潜在的致病威胁等缺点。因此随着分子生物学和现代生物技术的发展，DNA疫苗以其独特的优势显示出在未来畜禽疫病控制中的诱人前景，它与传统疫苗相比，具有成本低、稳定、便于贮藏和运输、安全性高、在体内维持时间长、制备简单等优点。

国内外一些学者已经构建了一些鸡球虫DNA疫苗，但多集中在单价疫苗的研究上，关于多价DNA疫苗的研究未见报道。能够感染鸡的球虫公认的有7种，危害较大的有4种，分别是柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)和堆型艾美耳球虫(E.acervulina)，在临床上，这4种球虫多为混合感染，给养鸡业带来了巨大的危害，因此，研制能够同时抵抗4种球虫混合感染的多价DNA疫苗显得尤为重要。

同时随着分子生物学及免疫学技术的日益成熟，抗原分子表位的研究成了近年来新的发展趋势。研究表明，T细胞免疫应答反应在抗球虫免疫应答中处于核心地位，因而选择鸡球虫能够编码集中的T细胞表位的多种基因片段串联起来，将其构建成球虫多表位DNA疫苗，这样既增加了T细胞表位的浓度和密度，又增强了重组抗原的反应范围。因此本试验诣在构建出抗球虫混合感染的多价多表位DNA疫苗。

IL-2是细胞介导免疫中的一种重要的细胞因子，具有广谱的免疫增强作用，它能促进CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的分化增殖，维持T细胞生长，促进NK细胞和B细胞功能。许多研究表明，IL-2与球虫基因联合插入到DNA疫苗载体中所构建的免疫调节型DNA疫苗，产生的免疫保护效果要明显优于单独构建的DNA疫苗。

本发明运用DNAstar软件，对E.tenella的TA4、5401、pEtK2和mic4抗原基因，E.necatrix的NA4抗原基因，E.maxima的EMCDPK抗原基因和E.acervulina的LDH和3-1E抗原基因的抗原表位进行分析，每个基因选取1到2段T细胞表位比较集中的序列进行动物保护试验，筛选出免疫保护效果最好的抗原T细胞表位，并将这4种球虫的T细胞表位同时克隆到同一DNA疫苗载体pVAX1中，同时串联具有免疫调节作用的chIL-2作为基因佐剂，构建出能够抵抗4种球虫混合感染的免疫调节型多价多表位DNA疫苗，并进行免疫保护性试验，检测其对临床上危害最为严重的4种球虫的抵抗力，以期为该疫苗在临床上的应用提供参考。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够预防多种鸡球虫混合感染的免疫调节型多价多表位的DNA疫苗。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种鸡艾美耳球虫(Eimeria spp)多价多表位DNA疫苗，该疫苗包含其中插入T细胞表位集中的4个基因片段：NA4-1(E.necatrix)、TA4-1(E.tenella)、EMCDPK-1(E.maxima)以及LDH-2(E.acervulina)，NA4-1、TA4-1、LDH-2、EMCDPK-1核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1的第1-312个碱基，第319-645个碱基，第652-984个碱基，第991-1299个碱基。

所述的4个基因片段NA4-1、TA4-1、EMCDPK-1和LDH-2通过连接成融合基因NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1的形式插入真核表达载体中，该融合基因NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1序列如SEQ ID NO.40所示。