[发明专利]拟南芥热激因子HSFA1d特异cDNA 片段的原核表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种高效表达拟南芥热激因子HSFA1d特异cDNA片段（△C-AtHsfA1d）的原核表达载体pET32a-△C-AtHsfA1d及其在制备△C-AtHsfA1d重组蛋白中的应用。

 

背景技术

HsfA1d是拟南芥热激转录因子（Hsf）家族成员之一。基于植物不同发育阶段、不同组织和不同胁迫条件诱导下mRNA水平Hsf表达谱的分析数据，植物Hsfs被认为能广泛的参与热、光照、臭氧、H₂O₂、盐、干旱、冷、损伤和病原菌侵害等多种胁迫应答，且不同的Hsf成员可能受不同的胁迫条件所诱导、从而特异性地在不同的胁迫应答中发挥作用(Miller and Mittler, 2006; Pascal et al., 2006)。因此，通过对不同Hsf成员在不同诱导条件下，不同Hsf家族成员mRNA和蛋白质水平表达量的检测，有助于探知各Hsf的功能。

拟南芥有包括HsfA1d在内的21个热激转录因子家族成员，生物信息学的分析表明，它们具有相同的结构域组成，包括：DNA结合域、寡聚域、核定位信号和C末端的激活域。对HsfA1d序列相似性的分析表明，HsfA1d与拟南芥中其它Hsf成员在DNA和蛋白质结构上有较高的同源性。目前，有关逆境胁迫下HsfA1d表达水平检测的研究，主要集中在mRNA水平，未涉及HsfA1d特异抗体的制备和蛋白质水平的表达特性分析。Yamada等为了验证HsfA1d 在体外与热激转录元件HSE3的相互作用，将全长HsfA1d与pET32a融合，成功的表达了全长HsfA1d活性蛋白并检测到其在体外与HSE3的相互作用 (Yamada et al., 2007)。但此蛋白并未用于HsfA1d抗体制备，且它针对的是HsfA1d的全长序列，未考虑特异性的因素，也不适合用于HsfA1d特异抗体的制备和蛋白水平HsfA1d的定量分析。 

发明内容：

本发明的目的在于提供一种拟南芥热激因子HSFA1d特异cDNA片段△C-AtHsfA1d的原核表达载体pET32a-△C-AtHsfA1d，该载体含有T7启动子和终止子、一个由6个氨基酸组成的组氨酸标签His-Tag和HsfA1d的cDNA特异性片段序列△C-AtHsfA1d；其中△C-AtHsfA1d基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠△C-AtHsfA1d片段的起始密码子上游是一个由6个氨基酸组成的组氨酸标签序列His-Tag；载体中的△C-AtHsfA1d基因来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana, 生态型Col）HsfA1d的cDNA，在GenBank中的登录号为AT1G32330。

利用该载体转化大肠杆菌BL21，可实现△C-AtHsfA1d蛋白的高水平表达，且在BL21系统中表达可溶性的△C-AtHsfA1d蛋白，通过HisTrap 亲和柱和割胶纯化的△C-AtHsfA1d重组蛋白质，可用于HSFA1d特异性抗体的制备。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

1、△C-AtHsfA1d cDNA片段的扩增

从GenBank中查找拟南芥21个HSF家族成员的蛋白质序列，通过Cluster X1.0分析，选取AtHsfA1d蛋白质序列中特异性区段，即氨基酸332-氨基酸485。并将该特异区段命名为△C-AtHsfA1d。从NCBI数据库获得△C-AtHsfA1d蛋白区段对应的cDNA序列，并设计序列如下的一对引物：

Sense primer：5' CGGAATTCTCTGAGATACAGTCATCATCACC3'；

Antisense primer：5' CCGCTCGAGTAGGATTTTGCCTTGAGAGAT 3'；