[发明专利]适用于高温和强酸环境的生物敏感多层膜及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于电化学生物传感器技术领域，特别是涉及一种适用于高温和强酸环境的生物敏感多层膜及其制备方法。

背景技术

电化学生物传感器具有体积小、成本低、准确、灵敏、易操作、可现场检测等优点，因此国内外对电化学生物传感器开展了广泛深入的研究。其中利用氧化还原蛋白或氧化还原酶与电极间的直接电子传递进行检测的第三代电化学生物传感器更是备受人们关注，是当前电化学生物传感器研究领域的热点。

温度和pH值是影响氧化还原蛋白和氧化还原酶生物活性的重要因素，因此温度和pH值对相应电化学生物传感器的性能也有重要影响，当前电化学生物传感器多难以在高于室温的较高温度或强酸碱等苛刻条件下使用。

目前提升蛋白或酶的耐高温或耐酸碱性能，大多采用较复杂的生物方法，如对蛋白或酶进行改性等，以提高其活性适应范围。如在文献(1)Talanta，2009，79：1412-1417中，Melek Ozkan等人通过复制耐热细菌热纤梭菌得到了热纤梭菌-乳酸脱氢酶，再利用聚吡咯和三磷酸甘油酸的聚合物，将酶固定到金电极表面上，用于在较高温度下检测人血清中的乳酸含量。这种改性后的乳酸脱氢酶在50℃时线性范围最宽，60℃时灵敏度最高，为25℃时灵敏度的70倍以上。但是这种生物改性方法过程繁琐，对酶的要求苛刻，难以广泛应用。

层状二维纳米材料具有可插层性、良好的生物相容性和化学稳定性，将其用于蛋白或酶的固定，构建化学修饰电极也受到电化学工作者的广泛关注。在文献(2)Adv.Funct.Mater，2007，17：1958-1965中，Ling Zhang等人将肌红蛋白插入二氧化钛纳米片层间构建蛋白质修饰电极并对其直接电化学行为进行了研究。该电极对过氧化氢具有良好的电催化活性，同时具有一定的热稳定性。但此方法提升蛋白质耐高温性能的效果有限，只是随着温度升高蛋白质活性减少幅度较小。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于高温和强酸环境的生物敏感多层膜及其制备方法，即含磷酸锆纳米片、氧化还原蛋白或氧化还原酶、脱氧核糖核酸，且适用于高温和强酸环境的生物敏感多层膜及其层层组装。

本发明生物敏感多层膜由磷酸锆纳米片层与复合生物活性物质层重复叠加构成，其组成可描述为(磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)_n。其中磷酸锆纳米片带负电，厚度为1～20nm，径向尺寸为300～1500nm；复合生物活性物质带正电，由氧化还原蛋白或氧化还原酶与脱氧核糖核酸复合而成，氧化还原蛋白或氧化还原酶为肌红蛋白、血红蛋白、细胞色素C、辣根过氧化物酶中的一种，脱氧核糖核酸为市售脱氧核糖核酸，如鲱鱼精脱氧核糖核酸等，氧化还原蛋白或氧化还原酶与脱氧核糖核酸的质量比为4∶1～2∶1；n为组装的(磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)膜的层数，取值范围为1～6。

本发明制备生物敏感多层膜的方法是利用带相反电荷的磷酸锆纳米片和复合生物活性物质间的静电作用，依次层层组装到玻碳电极表面，具体工艺步骤为：

将玻碳电极清洗干净，然后用N₂吹干；将该电极浸入到浓度为20～30g/L的聚苯乙烯硫酸钠水溶液或聚苯乙烯基磺酸钠水溶液中，15～30分钟后取出，用N₂吹干；将该电极浸入浓度为0.5～2.0g/L的磷酸锆纳米片溶胶中，15～30分钟后取出，用蒸馏水冲洗干净，用N₂吹干；再将该电极浸入浓度为2.5～6.0g/L的复合生物活性物质水溶液中，10～30分钟后取出，用蒸馏水冲洗干净，用N₂吹干，完成一层(磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)膜的制备；重复以上步骤，制备出(磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)_n多层膜修饰电极。