[发明专利]一种针对人TNF-α分子的自体疫苗的构建方法有效
| 申请号： | 201110303946.1 | 申请日： | 2011-10-10 |
| 公开（公告）号： | CN102370979A | 公开（公告）日： | 2012-03-14 |
| 发明（设计）人： | 张英起;万一;薛晓畅;王增禄;赵宁 | 申请（专利权）人： | 中国人民解放军第四军医大学 |
| 主分类号： | A61K39/395 | 分类号： | A61K39/395;C12N1/21;C12N15/62;C07K19/00;A61P19/02;A61P29/00;A61P35/00 |
| 代理公司： | 北京鼎佳达知识产权代理事务所(普通合伙) 11348 | 代理人： | 蒋常雪 |
| 地址： | 710032 *** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 针对 tnf 分子 疫苗 构建 方法 | ||
1.一种体内诱导出针对人TNF-α分子的自身抗体的蛋白疫苗的构建方法，其特征在于，将融合基因(TNF-α1-128-PADRE-TNF-α142-157)克隆入原核表达载体pET22b的Nde I和Sal I多克隆位点之间，将获得的重组表达载体转化大肠杆菌BL21，诱导后表达产物为包涵体，经包涵体洗涤，凝胶过滤柱层析，透析复性，即可获得纯化的目的融合蛋白，将该一种体内诱导出针对人TNF-α分子的自身抗体的蛋白疫苗，在不使用佐剂的情况下免疫小鼠可产生高滴度抗人TNF-α自身抗体，其中所述融合基因序列为：
5’-CATATGGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAA
CCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGG
CGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAG
GTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCA
TCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGA
GACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCA
GCTGCAATTGGCTAAATTCGTTGGTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCTCGACTTTGCCGAG
AGTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGAGTCGAC-3’
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其基因的构建按以下步骤完成：
根据人TNF-α氨基酸序列以及PADRE氨基酸序列(AKFVAAWTLKA)，设计hTNF-PADRE基因序列，基因序列中PADRE的插入位点为TNF-α的128位后面，即用PADRE编码序列取代人TNF129-141位氨基酸的编码序列；
其中TNF-α的1-128位氨基酸编码序列通过PCR扩增获得，并且在上游引入Nde I酶切位点(CATATG)，其中含有翻译起始密码子；下游引入Mun I酶切位点(CAATTG)；人工合成PADRE-TNF-α142-157的编码序列，上下游分别引入Mun I和Sal I(GTCGAC)酶切位点，另外在合成片段中将基因进行了两个点突变(T439→A、C440→G)；
两段基因通过Mun I酶切位点进行连接，融合基因克隆入载体pET22b的Nde I和Sal I酶切位点之间；
将上述表达载体转化大肠杆菌BL21，测序正确的质粒命名为pET22b-hTNF-PADRE，工程菌命名为pET22b-hTNF-PADRE/BL21；其所述基因序列如下：
5’-CATATGGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAA
Nde I
CCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGG
CGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAG
GTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCA
TCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGA
GACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCA
GCTGCAATTGGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCTCGACTTTGCCGAG
MunI PADRE
AGTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGAGTCGAC-3’。
突变位点 Sal I
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