[发明专利]一种从重组蛋白制品中提取残留DNA的磁珠法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种从重组蛋白制品中提取残留DNA的磁珠法。

背景技术

随着生物医药技术的发展，越来越多的哺乳动物细胞用于生产重组蛋白质，比如：单克隆抗体、细胞因子、激素、生长因子、其它还有某些酶类、凝血因子等。涉及到的治疗领域也越来越广泛，包括内分泌、心脑血管、外科、血液病、抗肿瘤等等。重组蛋白制品的用量随着临床治疗效果的需求也越来越大，由微克级上升到了毫克甚至克级。需长期重复用药的生物产品也越来越多。这使得我们技术审评部门不得不更加重视由于DNA残留所带来的安全性担忧。

自从上世纪80年代末，利用杂交瘤技术和重组DNA技术生产的鼠源性单克隆抗体在各国被批准使用，管理当局就已经认识到这类产品的安全性问题。理论上，存在于生物制品中的微量的外源DNA杂质，都有可能传递与肿瘤或病毒相关的基因，并导致癌变或其它病理变化。当残留的DNA与制品一同注射到人体后，含有致癌基因的细胞DNA就可能诱发肿瘤的产生；如果含有某些可以整合的病毒的DNA，这种DNA还可以进入宿主细胞，表达后感染受体，导致一系列的不良后果。

鉴于外源DNA对机体所具有的潜在危害，各国药品监督管理机构对生物制品中残留DNA的态度都十分谨慎，对生物制品中外源DNA残留量有着严格的限度控制，同时要求生物制药企业建立残留DNA检测方法，用于监测并验证纯化工艺去除该杂质的能力，及终产品残留DNA的检测与产品放行。美国FDA及我国SFDA均规定采用连续细胞系生产的纯化生物制品中宿主DNA残留量不得超过100pg/剂。

目前，已有的残留DNA检测方法主要包括固相斑点杂交法、荧光法、DNA结合蛋白法及q-PCR法等。杂交法虽然价廉易得，但其仅为一限量方法，实验周期较长、步骤繁琐，有被其他方法取代的趋势。而其他3种定量方法又以q-PCR法为优，因其具有专一性强、灵敏度高、快速且可实现高通量等优点，该法正越来越被广泛应用于残留DNA的检测。采用q-PCR法需先提取样品中的残留DNA，而DNA的提取效率将直接影响后续的定量结果，因此，DNA的提取效率成为衡量该法准确度的重要指标之一。DNA提取效率常用DNA的回收率来表示，即先向样品中添加已知量DNA，再对样品中DNA进行提取和定量，通过计算DNA实际提取量与DNA已知量的比值得到DNA回收率。对于一个准确稳定的DNA提取方法，SFDA要求DNA回收率应在70％-130％之间。

传统的DNA提取方法苯酚-氯仿法，虽然成本较低，但步骤繁琐、耗时长、DNA损失率高，难以实现从大量蛋白样品中对痕量DNA的有效提取。磁珠法为一种新型的DNA提取方法，可以从复杂的基质或样品中提取DNA，同时还可以对DNA进行浓缩，该方法方便快捷，整个实验仅需2-3小时即可完成。采用磁珠法提取重组蛋白制品中的DNA，其基本步骤及常规条件如下：

a)样品准备：低吸附离心管加入100μl样品溶液，调节NaCl浓度至约0.5M，调节pH至7-8之间；

b)酶切：向离心管中加70μl蛋白酶K溶液(3mg/ml)，56℃孵育30min。

c)DNA结合：酶切后向离心管中加360μl裂解液、30μl磁珠及300μl异丙醇，高速振荡5min，离心管快速离心15s，置于磁力架，静置至溶液澄清后小心移走液体；

d)DNA清洗：加入300μl清洗液，轻微振荡后快速离心，然后将离心管再放入磁力架，静置至溶液澄清，小心移走液体，重复上述清洗步骤一次；

e)DNA洗脱：待离心管中磁珠挥发干后，加50μl洗脱液，70℃水浴7min，其间每隔2-3min将离心管取出迅速振荡混匀，快速离心后，将离心管置于磁力架上，静置2-3min，小心转移液体至新的1.5ml离心管中，高速离心＞14000g、3min，再次将离心管放入磁力架，转移DNA溶液至新的离心管中。

采用上述方法条件对常规样品(如添加了DNA的高浓度BSA溶液或缓冲液)中的DNA进行提取，即使添加的DNA量仅4pg，其回收率仍能达到70％以上。然而同样的方法条件对重组蛋白制品，特别是高浓度的重组蛋白制品中DNA进行提取时，即使添加的DNA量高达40pg，所得的DNA回收率也不足30％，准确度无法达到相关法规要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题：采用现有磁珠法提取重组蛋白制品中DNA时DNA回收率偏低的问题。