[发明专利]一种改造的sacB基因及其衍生的整合型载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种改造的基因及依托其构建的整合型载体，特别是一种改造的sacB基因及其衍生的整合型载体。

背景技术

随着棒状杆菌生理学，生物化学和遗传学知识的大量累积，基于理性设计的代谢工程育种在氨基酸高产菌株选育中的地位越来越重要。基因敲除和替代技术是棒状杆菌代谢工程育种研究中主要分子生物学技术之一。基因敲除和替代技术是自80年代未以来发展起来的一种分子生物学技术，通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失或被其他替代的。一般是利用微生物体内的同源重组系统，在一定选择压力下使体外改造的DNA片段与受体细胞染色体上的功能基因之间发生同源重组，从而改变细胞的遗传特性。利用基因敲除技术可阻断细胞的代谢旁路，或通过引入突变位点来调节代谢流，优化代谢途径，最终达到微生物育种的目的。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)sacB基因编码的果聚糖蔗糖酶，是枯草芽孢杆菌的一种外分泌酶，它受蔗糖诱导表达，能将蔗糖分解成葡萄糖和果糖，还可进一步将果糖聚合成果聚糖。在培养基中存在蔗糖的条件下，细胞内果聚糖蔗糖酶的表达对革兰氏阴性菌有致死作用(Gay，P.，Le Coq，D，Steinmetz，M.，Berkelman，T.，Kado，C.I.，1985.Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elemems in gram-negative bacteria.J Bacteriol.164，918-21.)。在培养基中存在蔗糖的条件下，细胞内表达果聚糖蔗糖酶，对棒杆菌属、分枝杆菌属两种革兰氏阳性菌也具有致死作用(Pelicic.V.，Reyrat，J.M.，Gicquel，B.，1996.Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria.J Bacteriol.178，1197-9；Schafer，A.，Tauch，A.，Jager，W.，Kalinowski，J.，Thierbach，G.，Puhler，A.，1994.Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19：selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum.Gene.145，69-73.)。基于这一发现，Schafer等用sacB基因作为一个条件致死型标记，发展了一种携带抗生素抗性与sacB双标记的新型整合型载体。基于双标记的pK18mobsacB能够对谷氨酸棒状杆菌染色体基因实施进行无痕敲除及替代。该载体使用sacB自身的启动子和SD序列，限制了应用范围；应用该载体进行基因敲除时，由于IS插入片段的插入，不同比例的出现蔗糖抗性、抗生素抗性的菌落，给实验带来不必要的麻烦。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种改造的sacB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述sacB基因用作筛选标记亦为本专利要求的保护范围。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种依托改造的sacB基因构建的整合型载体，含有优化的组合启动子PlacM及SD序列、改造的sacB基因、多克隆位点MCS及抗生素筛选标记，以消除蔗糖抗性、抗生素抗性的问题，大大减少应用中不必要的麻烦。其中，sacB自身的启动子、sacR和SD序列均被去除，处于优化的组合外源PlacM和SD序列下，表达更加良好。多克隆位点MCS，含有多个限制性内切酶切位点，位于外源启动子PlacM及SD序列上游。

所述的整合型载体pDXW-3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明中，sacB处于强启动子PlacM和优化的SD下，表达更加良好。另外，sacB自身的启动子、sacR和SD序列均被去除，应用时几乎不会出现蔗糖抗性、抗生素抗性的菌落，大大减少应用中不必要的麻烦。因此本发明即获得了一个能在棒状杆菌广泛，高效的整合型载体。

附图说明

图1整合型载体pDXW-3的物理图谱

具体实施方式