[发明专利]肠道病毒71型VP1蛋白的原核表达及含有该蛋白的疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和制药领域，具体地说，涉及肠道病毒71型VP1蛋白的原核表达及含有该蛋白的疫苗。

背景技术

肠道病毒(Enterovirus)71型(EV71)近年来在我国的流行呈逐年上升趋势，EV71所导致的主要疾病手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)于2008年被列入我国的法定传染病，近几年来，HFMD发病数和病死数上升迅速。目前临床治疗中主要采取对症治疗，尚无疫苗应用于临床治疗手足口病的报道。

目前处于研究阶段的EV71病毒疫苗按照免疫途径可分为注射型疫苗和口服型疫苗。注射型疫苗包括灭活EV71病毒疫苗、基因工程重组VP1蛋白疫苗、多肽疫苗、病毒样颗粒疫苗、核酸疫苗。灭活EV71病毒疫苗可以诱导产生较好的体液免疫反应，但是目前EV71病毒的纯化还存在一定难度，并且全病毒刺激机体免疫反应的机制还不是很清楚，而且成本较高；病毒样颗粒疫苗是从SF9细胞中纯化出的，但由于SF9细胞还不是疫苗生产用细胞，所以还存在安全隐患；多肽疫苗诱导产生的特异性抗体滴度较低；核酸疫苗不仅诱导产生的特异性抗体滴度较低，而且由于异源性基因的存在增加了体细胞基因重组的风险。口服型疫苗主要有沙门氏菌载体疫苗、可食性疫苗、减毒活疫苗，由于其无痛苦免疫途径所以易为目标人群所接受。但是，从目前研究阶段来看沙门氏菌载体疫苗和减毒活疫苗均存在致病的危险性；可食性疫苗是将EV71病毒VP1蛋白表达在果实，如番茄果实中，通过食用番茄果实达到免疫目的，诱导产生特异性抗体的免疫原性差，并且转基因食品的安全性还有待评估。

发明内容

本发明的目的是提供一种肠道病毒71型VP1蛋白的原核表达方法。

本发明的另一目的是提供利用原核表达系统获得的肠道病毒71型VP1蛋白在制备抗肠道病毒71型疫苗中的应用。

本发明的进一步目的是提供含有由原核表达系统获得的肠道病毒71型VP1蛋白的抗肠道病毒71型疫苗。

为了实现本发明目的，本发明的一种肠道病毒71型VP1蛋白的原核表达方法，其是将肠道病毒71型的VP1基因序列克隆至原核表达载体中，并转化至大肠杆菌中进行诱导表达。优选地，所述原核表达载体为pET30a，所述大肠杆菌为BL21(DE3)大肠杆菌。

前述的方法，其中肠道病毒71型VP1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将第20位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，或是将第1位的甘氨酸缺失，或是在297位后添加组氨酸均不会影响VP1蛋白的功能。

前述的方法，其中肠道病毒71型的VP1基因序列如SEQ ID No.1所示。

前述的方法中还包括对表达的VP1蛋白进行纯化和复性。

本发明还提供采用上述原核表达方法获得的VP1蛋白在制备抗肠道病毒71型疫苗中的应用。

本发明进一步提供含有由上述原核表达方法获得的VP1蛋白的抗肠道病毒71型疫苗。所述疫苗为注射型疫苗或口服型疫苗。其中，注射型疫苗中使用的佐剂为氢氧化铝、磷酸铝佐剂、MF59佐剂或弗氏佐剂等。口服型疫苗中使用的佐剂为壳聚糖、霍乱毒素B亚单位、或大肠杆菌不耐热肠毒素等。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

由于EV71病毒的中和表位主要位于其结构蛋白VP1上面，因此在本发明中，将EV71病毒的VP1基因序列克隆至原核表达载体pET30a中，将构建好的表达质粒命名为pET30a-VP1。用pET30a-VP1转化工程表达菌BL21(DE3)，然后用IPTG对VP1蛋白进行诱导表达。通过亲和层析柱对带有His标签的VP1蛋白进行纯化(或采用其它蛋白纯化方法)，最后对纯化出的VP1蛋白进行复性，并将蛋白的缓冲液更换为高压过滤的磷酸盐缓冲液。