[发明专利]铂类药物疗效相关基因SNP检测特异性序列和液相芯片

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及铂类药物疗效相关基因ERCC1、ERCC2、XRCC1和GSTP1的SNP检测的特异性序列和液相芯片。

背景技术

自从1967年顺铂的抗癌活性被发现以来，铂类抗癌药物的研究和应用得到了迅速的发展。目前已发展出以卡铂为代表的第二代，和以奥沙利铂为代表的第三代铂类药物。铂类是目前常用的广谱抗肿瘤药，已成为癌症化疗中不可缺少的药物。铂类药物的疗效虽得到广泛认可，但患者用药后药效的个体差异很大、且有不同程度的毒副作用。其副作用主要是消化系统毒性，常见为恶心、呕吐，还可有肾毒性、肝毒性和骨髓抑制，耳毒性和神经毒性较轻。

铂类药物的抗肿瘤作用是通过作用于DNA，形成Pt-DNA结合物，导致DNA的链内和链间交联，从而抑制DNA的合成及复制。大量的临床研究已经证实，铂类药物的疗效/毒副作用与患者体内四个基因的单核苷酸多态性(SNP)关系密切，即ERCC1、ERCC2、XRCC1和GSTP1。ERCC1和ERCC2都是DNA核苷酸切除修复途径的关键基因，XRCC1是DNA碱基切除修复途径中的重要因子。GSTP1是一种谷胱甘肽S转移酶，它通过将有毒物质的亲电子基团与谷胱甘肽结合，起到保护细胞大分子的作用。这四个基因通过参与DNA修复等生理过程，使受铂类化合物破坏的DNA回复正常或使DNA免受破坏，在肿瘤细胞中造成耐药，而在正常细胞中则能够减少毒副作用。因此，专家推荐患者在接受铂类化疗之前，进行相关的基因SNP检测，帮助临床医生根据患者的个体差异制定个体化用药方案。这样将明显提高药物疗效，减少药物毒副作用的发生。

大量临床研究显示，最常见的造成这四个基因功能减弱的多态性位点分别是ERCC1的C19007T和C8092A，ERCC2的A2282C，XRCC1的G1301A，以及GSTP1的A1578G。在中国人群中，ERCC1-C19007T、ERCC1-C8092A、ERCC2-A2282C和XRCC1-G1301A的基因分布频率分别约为21％、24％、5％和30％；GSTP1-A1578G基因分布频率约21％。大量研究表明，在ERCC1、ERCC2、XRCC1这三个基因中携有一个或以上功能减弱等位基因型的患者，在接受铂类化疗时，发生毒副作用的几率明显升高，以致治疗效果较差。而GSTP1-A1578G基因多态性位点的情况正好相反，遗传基因型为GA或GG的患者，在接受铂类化疗时，对铂类药物的反应率较高、有较好的疗效。因此，通过对这五个常见功能SNP位点进行检测，根据患者的基因型判断是否采用铂类药物或制定个体化用药方式，将能明显提高药物疗效，减少药物毒副作用的发生。

目前已建立了若干以PCR为基础的检测基因单核苷酸多态性(SNP)的技术，如直接测序法，半定量PCR技术，PCR-单链构象多态性分析(SSCP)检测，以上技术具有灵敏度低，样品易污染、假阳性率高等缺点。普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性不能满足临床的需要。而聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)分析技术和基于TaqMan技术的等位基因差异分析法一次只能进行一种SNP位点的检测，耗时费力；传统的固相芯片价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果的可重复性差。基于芯片的原理，美国Luminex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型；绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此，液相芯片技术既满足了高通量检测的要求，同时具备了快速准确，灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优点。我们采用x-Taq液相芯片技术可以同时检测多个SNP位点，实现高通量快速简便化操作，大大提高了检测效率，在同类检测技术中处于领先地位。

发明内容