[发明专利]微生物共栖培养发酵生产河豚毒素的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种从野生河豚的多种含毒组织中分离其共生微生物和发酵培养方法。

技术背景

河豚毒素(tetrodotoxin，TIX)是一种毒性较强的小分子非蛋白类神经毒素，由于其可与神经细胞膜的钠离子通道受体高度特异性的结合，阻断钠离子通道，从而抑制神经冲动的传导。TTX具有出色的神经止痛作用，其麻醉作用比一般麻醉药强1000倍以上，而且具有不成瘾的优点，可取代化学药物和中草药用于戒毒。同时，它还具有来镇静、抗心律失常、预防肾功，能衰竭及降血压等作用。因而其具有很大的药用开发价值。由于河豚毒素具有极强的医疗效果，而提取工艺复杂﹑不易提取，且产量非常低，目前国际上只有日本﹑中国﹑韩国﹑加拿大等少数几个国家有研究和生产的报道，因此国际市场上高纯度的河豚毒素每克价格高达18-20万美金。

目前河豚毒素的生产方法主要有化学合成法、生物组织提取法、微生物发酵法。其中化学合成法步骤繁琐、得率低、产品纯度不高，而组织提取法需消耗大量的河豚鱼资源，破坏生态系统。近年来，很多学者报道了从河豚内脏中分离产毒菌及其发酵产河豚毒素的方法，据报道产TTX 的微生物类群包括细菌和放线菌。细菌有弧菌属的溶藻弧菌和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、希瓦氏菌属的腐败希瓦菌(Shewanella putrefaciens)和海藻希瓦氏菌，还有假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、发光菌属(Photobacterium sp.)、气单胞菌属(Aeromonassp.)、邻单胞菌属(Plesionsnanas sp.)、交替单胞菌属(Alteromonas sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)等。放线菌则主要是链霉菌属(Streptomyces sp.)。2003年清华大学曾提出了有关利用微生物生产河豚毒素申请（公开号CN1460721A），其利用的是单菌纯培养方式。尽管微生物发酵产河豚毒素取得了一定的进展，但由于单菌株纯培养发酵存在产毒菌株遗传特性不稳定，产量低等缺陷，至今微生物法产河豚毒素的产量仅为0.11-0.73MU/mL，使其难于实行大规模工业生产。因此，有必要对传统的微生物发酵产河豚毒素的发酵模式和工艺进行创新和改进。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从野生河豚组织分离微生物及发酵共培养产河豚毒素的方法。利用从野生含毒河豚鱼中各个含毒部位（卵巢、肝脏、脾脏、腮等）分离出能和这些河豚鱼含毒器官共生的微生物群落。通过模拟这些微生物群落的生长环境，对微生物群落进行共栖发酵培养。在此共栖培养发酵过程中，具有产河豚毒素能力的微生物菌株，能在相应的微生物群落体系中很好的生长并保持较高的产生河豚毒素能力。经过适当的发酵工艺优化，得到的发酵液将含有较高浓度及高纯度的河豚毒素。

实现本发明的技术方案如下：

1、从野生河豚各含毒组织中分离微生物菌群的方法，包括如下步骤。

1）选取新鲜﹑健康的野生河豚鱼。

2）鱼体先用纯水洗净，在无菌环境下解剖鱼体，分别取出各新鲜的内脏组织，分别加入少量的已灭菌海水研磨匀浆，得到新鲜的河豚内脏匀浆液。

3）将各新鲜的匀浆液以已灭菌海水按比例制成系列稀释液，分别取稀释液涂布于固体培养基上。

4）24-35℃培养，观察并挑取平板上各个时期形成的不同特征的单菌落，划线于新的固体培养基上进行分离纯化，直至原代平板上不再长出新菌落为止。

5）将分离到的各菌株进行菌种鉴定，产毒性能测试，并按照组织来源分类保藏。

其中所述的野生河豚为正值产卵期的野生河豚鱼，其毒性最强；海水为天然海水或用海水精配成的3%的人工海水。

其中分离培养基按质量百分比的组成为：酵母膏0.1-0.5%，牛肉膏0.1-0.5%，蛋白胨0.1-0.5%，葡萄糖0.5-2%，蔗糖0-2%，河豚组织提取液1mL，余量为海水，琼脂2-3%，pH6.5-7.2。

2、河豚组织微生物的共培养方法，其特征在于，包括如下步骤。

1）将上述得到的各菌株用无菌蒸馏水制备成菌悬液，混合各菌悬液接种到同一液体培养基中进行种子液培养1-3天。

2）将种子液以5-10%的接种量接种于发酵培养基中发酵培养，2-7天。